肖春萍，韓 梅，楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，省部共建生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點實驗室培育基地，吉林長春130118）

2株人參生防真菌發(fā)酵液穩(wěn)定性的研究

肖春萍，韓 梅，楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，省部共建生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點實驗室培育基地，吉林長春130118）

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法及菌絲生長速率法，研究了2株人參生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵液的穩(wěn)定性.結(jié)果表明：2株生防真菌發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性較弱，其發(fā)酵液在低溫下（≤40℃）抑菌活性穩(wěn)定，在中高溫下（＞40℃）抑菌活性逐漸下降乃至失活；2株生防真菌發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性較差，在pH＜5或pH＞9的條件下其抑菌活性逐漸減弱；生防真菌FSR－74發(fā)酵液具有較強的紫外穩(wěn)定性，但生防真菌FSR－97發(fā)酵液的紫外穩(wěn)定性較弱；生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵液具有較好的低溫儲藏穩(wěn)定性，室溫下隨儲藏時間的延長對人參病原菌的抑菌率均顯著下降；2株生防真菌發(fā)酵液抗胰蛋白酶穩(wěn)定性較差；生防真菌FSR－74和FSR－97均具有良好的傳代穩(wěn)定性.生防真菌FSR－74和FSR－97的代謝產(chǎn)物有較強的低溫儲藏穩(wěn)定性，具有一定開發(fā)價值，在不同植物病害防治應用中應在合理的溫度、光照及pH范圍內(nèi)使用.

人參；生防真菌；發(fā)酵液；穩(wěn)定性

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國的名貴藥材，有“百草之王”的美譽.人參在中國、韓國、朝鮮、俄羅斯等國家均有大面積種植.其中，中國東北特別吉林省是人參的主產(chǎn)區(qū)，已成為當?shù)氐闹匾еa(chǎn)業(yè)之一［1］.人參的長期人工種植導致人參種質(zhì)退化、病害嚴重，人參制品質(zhì)量差、產(chǎn)量低.長期以來通過使用化學農(nóng)藥等化學防治措施防治人參病害并未達到預期效果，而且化學農(nóng)藥過量使用不僅會破壞土壤微生態(tài)環(huán)境，加重環(huán)境污染，也使有毒物質(zhì)在參根內(nèi)大量積累，降低了人參的使用安全性和商品價值［2］.因此，植物病害防治重點逐步轉(zhuǎn)向了生物防治和農(nóng)業(yè)防治措施上.在農(nóng)作物植物保護領域，利用作物的健株根際土壤篩選對病原菌具有顯著生防效果的土壤微生物，并制成微生物菌劑，這是生物防控研究的重要手段之一，也是有益微生物資源開發(fā)利用的重要途徑［3］.

真菌是一類具有巨大實用價值的微生物，其中已有許多類群被應用于植物病害的防治［4－5］，真菌中含有的多種抑菌活性物質(zhì)逐漸受到人們的關(guān)注.真菌發(fā)酵產(chǎn)物施用時，會受到陽光、溫度、土壤的酸堿性等各種因素的影響，因此，真菌發(fā)酵產(chǎn)物在各種環(huán)境條件下的穩(wěn)定性是評價該真菌是否有開發(fā)價值的重要指標之一［6］.熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性等也是微生物次級代謝產(chǎn)物開發(fā)的重要衡量依據(jù)［7］.本文從人參健株根際土壤中分離篩選出2株具有高效廣譜抑菌活性的生防真菌FSR－74和FSR－97，對其在熱、酸堿、紫外線等條件下的穩(wěn)定性進行了研究，以為菌株FSR－74和FSR－97的進一步開發(fā)利用提供評價依據(jù)和實踐基礎.

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 供試菌株

人參生防真菌FSR－74和FSR－97，篩選自人參健株根際土壤.

1.1.2 供試靶標菌

選用5種引起人參真菌性病害的病原菌，分別為引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病及人參灰霉病的腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、人參鏈格孢菌（Alternaria panax）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），以上菌株均由吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室分離、鑒定.

1.2實驗方法

1.2.1 人參生防真菌無菌發(fā)酵液的制備

將保存的人參生防真菌FSR－74，F(xiàn)SR－97菌株在PDA平板上分別進行活化，并用打孔器各取2個5mm菌餅分別接入到50mL的葡萄糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）中，25℃，170r／min振蕩培養(yǎng)48h，得到種子液；種子液以10%的接種量接入到100mL的PDB液體培養(yǎng)基中進行二次發(fā)酵，25℃，170r／min振蕩培養(yǎng)4d后獲得培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液8 000r／min離心20min，上清液即為發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)細菌過濾器（濾膜孔徑0.22μm）過濾獲得無菌發(fā)酵液.

1.2.2 生防真菌發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

（1）發(fā)酵液的熱處理.將2株生防真菌的發(fā)酵液分別于40℃，60℃，80℃，100℃和120℃條件下處理60min，每個處理3次重復.待自然冷卻后，以原發(fā)酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（2）發(fā)酵液的酸堿處理.將2株生防真菌發(fā)酵液用1mol／L HCI和1mol／L NaOH分別調(diào)整pH至3，5，7，9，11和13，靜置6h后，再分別將各發(fā)酵液的pH慢慢調(diào)至原發(fā)酵液的pH值7.2，每個處理3次重復.以原發(fā)酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（3）發(fā)酵液的紫外處理.將2株生防真菌發(fā)酵液置于30W紫外燈下（距燈管20cm）分別照射30，60，90，120和150min，每個處理3次重復.以原發(fā)酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（4）儲藏穩(wěn)定性測定.將2株生防真菌發(fā)酵液分別置于室溫（25℃）和4℃冰箱內(nèi)，保存1，8，15，22和29d，每個處理3次重復.以原發(fā)酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（5）抗胰蛋白酶K穩(wěn)定性的測定.分別在2株生防真菌的1mL發(fā)酵液中加入5μL胰蛋白酶K溶液（質(zhì)量濃度20mg／mL），充分混勻并置于37℃搖床中撫育2h，每個處理3次重復.以原發(fā)酵液為對照，分別測定其對各人參病原菌的抑菌活性.

（6）傳代穩(wěn)定性研究.將2株生防真菌在PDA平板上連續(xù)傳代10次，每隔7d傳代1次，觀察每代菌株的培養(yǎng)特征是否一致；采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法測定各代菌株發(fā)酵液的抑菌活性，以第1代菌株發(fā)酵液為對照，每處理3次重復.

1.2.3 對人參病原菌抑菌活性的研究

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法及菌絲生長速率法［8］測定FSR－74和FSR－97菌株無菌發(fā)酵液對5種人參病原菌的抑菌作用.分別將FSR－74和FSR－97無菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶4的比例（體積比）混合，配制成含藥培養(yǎng)基，然后將5種人參常見病原菌菌餅分別置于相應含藥培養(yǎng)基中央，以混合無菌水作空白對照，5次重復，25℃下恒溫培養(yǎng)，6d后測量各人參病原菌菌落半徑并計算抑菌率.

抑菌率＝（對照菌落擴展半徑－處理菌落擴展半徑）／對照菌落擴展半徑×100%

1.3數(shù)據(jù)處理

所得實驗數(shù)據(jù)采用Excel和DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析.采用單因素方差分析（Duncan’s新復極差法）進行生防真菌發(fā)酵液穩(wěn)定性差異顯著性的檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1生防真菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

由圖1可知，人參生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵產(chǎn)物中的活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性較差.菌株FSR－74和FSR－97的發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度處理后，隨處理溫度升高，其對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、鏈格孢菌和立枯絲核菌的抑制率逐漸下降，但對灰葡萄孢菌的抑制作用影響不大.其中，菌株FSR－74發(fā)酵液經(jīng)40℃處理后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌的抑菌率分別下降33.33%和31.41%；經(jīng)60℃處理后，對立枯絲核菌的抑制率下降顯著；40℃～100℃處理時，對人參鏈格孢菌的抑制率影響不顯著；120℃處理60min后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、人參鏈格孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分別比對照下降了77.75%，46.64%，59.43%，50.70%和35.47%.菌株FSR－97發(fā)酵液經(jīng)60℃處理后，對毀滅柱孢菌和人參鏈格孢菌的抑制率下降顯著，分別比對照下降了33.38%和45.26%；60℃～100℃處理時，對各人參病原菌抑菌率的影響不明顯；120℃處理60min后，對腐皮鐮孢菌、毀滅柱孢菌、人參鏈格孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分別比對照下降了61.18%，74.43%，74.19%，54.64%和10.22%.處理結(jié)果說明，低溫條件下（≤40℃），兩株生防真菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性較高；中高溫條件下（＞40℃），兩株生防真菌發(fā)酵液中的活性成分容易分解或易失活；兩株生防真菌發(fā)酵液熱處理后，對灰葡萄孢菌抑菌率的影響較小，且菌株FSR－97的熱穩(wěn)性優(yōu)于FSR－74.

2.2生防真菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

由圖2可知，生防真菌FSR－74，F(xiàn)SR－97發(fā)酵液經(jīng)中性條件處理后，其活性物質(zhì)的穩(wěn)定性較好，但經(jīng)酸性及堿性條件處理后，其活性物質(zhì)的穩(wěn)定性變差，且隨酸堿強度的增大，對活性物質(zhì)的影響增大.pH＝5或pH＝9時，兩株生防真菌發(fā)酵液對人參病原菌的抑菌率逐漸降低；在pH＝3時，菌株FSR－74發(fā)酵液對人參病原菌的抑菌率顯著下降了12.55%～77.87%，菌株FSR－97對人參鏈格孢菌、毀滅柱孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率顯著下降了30.67%～87.29%；在pH＝9時，菌株FSR－97發(fā)酵液對腐皮鐮孢菌的生長無抑制作用；而pH＝13時，菌株FSR－74發(fā)酵液對人參病原菌的抑菌率下降了54.21%～66.80%，菌株FSR－97發(fā)酵液對毀滅柱孢菌、立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了32.99%～90.70%.因此，兩株生防真菌在發(fā)酵液活性物質(zhì)分離、純化及使用過程中，酸堿性強度應保持中性.

2.3生防真菌發(fā)酵液紫外穩(wěn)定性

由圖3可知，隨紫外線照射時間的延長，菌株FSR－74的發(fā)酵液對5種人參病原菌生長的抑制率基本無顯著變化，說明生防真菌FSR－74發(fā)酵液對紫外線不敏感，有較強的紫外線照射穩(wěn)定性.生防真菌FSR－97的發(fā)酵液對紫外線較為敏感，紫外線照射時間延長至150min后，對5種人參病原菌的抑制率下降了21.65%～61.29%，說明菌株FSR－97紫外穩(wěn)定性較差，其發(fā)酵液在使用及保存時應盡量避光.

2.4生防真菌發(fā)酵液儲藏穩(wěn)定性

由圖4可見，在4℃條件下，生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵液的儲藏穩(wěn)定性較強；25℃儲藏22d后，F(xiàn)SR－74和FSR－97發(fā)酵液抑菌活性下降.29d時，菌株FSR－74的發(fā)酵液在4℃條件下，對人參鏈格孢菌、毀滅柱孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了9.21%～33.56，對立枯絲核菌的生長無顯著的抑制作用；在室溫條件下，對5種人參病原菌的抑菌率下降了35.42%～82.34%.菌株FSR－97的發(fā)酵液在4℃條件下儲藏29d時，對5種人參病原菌的抑菌率下降了13.76%～61.39%；而在室溫條件下，對5種人參病原菌的抑菌率下降了22.42%～87.28%.因此，兩株生防真菌發(fā)酵液的低溫儲存穩(wěn)定性較好，在低溫條件下，生防真菌FSR－74和FSR－97的發(fā)酵液能在29d之內(nèi)保持較高的抑菌活性.

2.5生防真菌發(fā)酵液抗胰蛋白酶K穩(wěn)定性

由圖5可見，兩株生防真菌的發(fā)酵液經(jīng)胰蛋白酶K處理后，對5種人參病原菌的抑菌率顯著低于對照，說明生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵后產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)在酶處理后穩(wěn)定性變差.

2.6生防真菌發(fā)酵液傳代穩(wěn)定性研究

從各代培養(yǎng)特征看，F(xiàn)SR－74，F(xiàn)SR－97在連續(xù)傳代過程中的形態(tài)特征與原始菌株相同；從抑菌活性看，F(xiàn)SR－74，F(xiàn)SR－97經(jīng)連續(xù)10次傳代培養(yǎng)后，其發(fā)酵液的抑菌活性基本不變（見圖6），說明生防真菌FSR－74和FSR－97具有良好的傳代穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

由于微生物農(nóng)藥的低毒、高效等特點，利用生防微生物防治植物病原微生物已成為生物防治技術(shù)的重要組成部分［9］.目前真菌是研究、生產(chǎn)和應用最多的一類生防微生物.生防真菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物已被作為微生物農(nóng)藥進行開發(fā)利用［6］.人參生防真菌FSR－74，F(xiàn)SR－97發(fā)酵液具有高效廣譜的抑菌活性，研究其代謝產(chǎn)物的廣譜性及穩(wěn)定性，對評價其在植物病害防治中的開發(fā)利用價值有重要意義.

對生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明：兩株生防真菌發(fā)酵液在低溫儲存、中性條件、使用溫度低于40℃及適量光照時，其抑菌活性穩(wěn)定；使用及儲藏溫度高、光照強、pH偏高或偏低時，都會導致發(fā)酵液抑菌活性的下降或失活.有研究發(fā)現(xiàn)，生防真菌通過產(chǎn)生有抑菌活性的物質(zhì)［10－11］或產(chǎn)生細胞降解酶［12］來抑制病原菌的生長，進而達到防治植物病害的目的.菌株FSR－74和FSR－97發(fā)酵液由于溫度、光照、酶及pH的影響，可導致活性物質(zhì)成分改變或作用酶失活，進而喪失抑菌活性.因此，生防真菌FSR－74和FSR－97發(fā)酵液的制備及其在不同植物病害防治的應用時應在合理的溫度、光照及pH范圍內(nèi)使用.另外，本實驗的發(fā)酵液為多種成分的復合體，不同條件對不同人參病原菌的抑菌穩(wěn)定性影響不同，因此發(fā)酵液中有效成分的含量及分子結(jié)構(gòu)還有待進一步的深入研究.

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Study on stability of fermentation broth from two antagonistic strains of Panax ginseng

XIAO Chun－ping，HAN Mei，YANG Li－min

（Chinese Medicinal Material College，Co－constructing Cultivation Base－key Laboratory by Province and the MOST of Ecological Restoration and Ecosystem Management，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

By means of containing poisonous medium culture and mycelial growth rate method，the stabilities of fermentation broths from antagonistic fungi strains FSR－74and FSR－97of Panax ginseng were studied.The results showed that thermal stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was stable less than 40℃and the activities were decreased gradually or lost in high temperature（＞40℃）.The pH stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was poor，and its antimicrobial activity was weakened gradually in the condition of pH＜5or pH＞9.UV stability of FSR－74fermentation broth was stronger while weaker for FSR－97fermentation broth.The fermentation broths from FSR－74and FSR－97were stable when storing in low temperature.The inhibition rates of FSR－74and FSR－97fermentation broths against ginseng pathogens was decreased significantly with the extension of storage time when storing in room temperature.Meanwhile，the fermentation broths from FSR－74and FSR－97were astable to trypsin K，while the antimicrobial activity of fermentation broths had no significant changes when the two strains were transferred for 10 generations.The active substances fermented by FSR－74and FSR－97with better storing stability have a value for development.As well as the temperature，illumination and pH must be controlled in a proper range in the prevention and control of plant diseases.

Panax ginseng；pathogenic fungi；fermentation broth；stability

S 432.2 ［學科代碼］ 210·60 ［

］ A

（責任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0105－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.020

2014－09－27

國家科技支撐計劃項目（2011BAI03B01－02）；國家自然科學基金資助項目（31270371）；吉林省科技發(fā)展計劃重點項目（20125068）.

肖春萍（1985—），女，博士研究生，主要從事藥用植物、土壤微生物區(qū)系變化研究；通訊作者：楊利民（1963—），男，博士，教授，博士研究生導師，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究.