黃婷婷，劉玉梅，張自強(qiáng)，張春燕，付文濤

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471003）

褪黑激素（melatonin，MT），化學(xué)名N－乙酰基－5－甲氧基色氨（N－acetyl－5－methoxytryptamine）是以色氨酸為原料在松果體內(nèi)合成的一種重要的吲哚類激素。20世紀(jì)50年代Lerner等從牛松果腺提取物中首次分離出能使青蛙皮膚褪色的物質(zhì)，并命名為MT。此后一系列的研究證明，MT 合成之后進(jìn)入血液和腦脊液而參與調(diào)控機(jī)體的晝夜節(jié)律、改善睡眠質(zhì)量、抑制腫瘤生長［1］、提高抗氧化功能［2］、抗細(xì)胞凋亡等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。文獻(xiàn)表明，MT 結(jié)合相應(yīng)受體在細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)MT 能夠選擇性的與MT 1b和MT 1c受體結(jié)合并通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）及其下游轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B，NF－κB）促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖［3］。謝有富等研究表明MT 可通過影響細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）、p53和Fas基因的表達(dá)，抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，在適合的條件下或給予合適的信號，它能夠向多種細(xì)胞分化。目前，干細(xì)胞在體外有效增殖和分化是其應(yīng)用于臨床的基本保障。但是有些干細(xì)胞體外增殖效率低，難以達(dá)到移植所需的數(shù)量。近年來，研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素能夠影響干細(xì)胞的生物學(xué)特性。本文綜述MT 對干細(xì)胞的增殖與分化的最新研究進(jìn)展，為干細(xì)胞有效的臨床應(yīng)用提供新參考。

1 褪黑激素的合成與分泌

MT 的合成與分泌具有明顯的節(jié)律性，主要受外界環(huán)境和光線的控制，連續(xù)光照可以抑制MT 的釋放，而黑暗條件下能夠刺激MT 的分泌。光照信息刺激到視網(wǎng)膜產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，經(jīng)下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）之后傳遞到頸上神經(jīng)節(jié)（superior cervical ganglia，SCG）。然后通過SCG 將交感輸入信息傳遞給松果體，經(jīng)松果體轉(zhuǎn)換為內(nèi)分泌信息輸出，交感神經(jīng)末梢按照晝夜節(jié)律釋放去甲腎上腺素。去甲腎上腺素與松果體細(xì)胞膜上的α－腎上腺素能受體或β－腎上腺素能受體結(jié)合，引起環(huán)核苷酶系統(tǒng)和5－羥色胺－N－乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的改變，進(jìn)而影響MT 的合成和分泌［4－5］。人們已經(jīng)在SCN，視網(wǎng)膜和松果體等中發(fā)現(xiàn)大量的MT 受體（MT1、MT2），并 且 還 發(fā) 現(xiàn)MT 受 體 的MT1 和MT2激活能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的功能，并將光信號傳輸?shù)酱竽X，調(diào)控機(jī)體的晝夜節(jié)律和季節(jié)性活動(dòng)。MT作為生物鐘信號在SCN 中可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)（MT1）控制信息的傳輸。

2 褪黑激素與胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES）來源于哺乳動(dòng)物的囊胚層，具有無限增殖、自我更新和多向分化的特性。研究證實(shí)ES細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞［6］、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肝細(xì)胞［7］等多種細(xì)胞類型。Yoo等研究MT 對胚胎干細(xì)胞（ESE14TG2a細(xì)胞系）轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，MT對ES細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、REX－1、Sox2和Zfp206mRNA 的表達(dá)未見明顯影響，但是MT（100 μmol／L）作用于ES－E14TG2a細(xì)胞24h后，細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著增多；且B 淋巴細(xì)胞瘤－2（B－cell lymphoma－2，Bcl－2）的表達(dá)顯著升高，而Bax的表達(dá)受到抑制，從而證明MT 促進(jìn)了ES－E14TG2a的增殖、抑制其凋亡。進(jìn)一步通過Western blot方法證實(shí)，MT 促 進(jìn) 了 絲 氨 酸 激 酶（set－inethreonine kinase，Akt）的磷酸化而抑制糖原合成激酶－3α／β（glycogen synthesis kinase－3α／β，GSK－3α／β）的活性，從而表明MT 影響ES－E14TG2a細(xì)胞增殖是通過激活磷 酯 酰 肌 醇－3－激 酶（phosphoinositide－3－kinase，PI3K／Akt）和β－鏈蛋白（β－catenin／Wnt）信號通路而實(shí)現(xiàn)［8］。Ashok等探討MT 對初級ES細(xì)胞集落形成的影響，發(fā)現(xiàn)MT（0.5mmol／L）作用于ES 8d～12d時(shí)可顯著增大細(xì)胞集落，并顯著升高了Oct－4和Nanog的表達(dá)，從而證實(shí)MT 能夠促使ES細(xì)胞增殖；促進(jìn)初級ES 細(xì)胞的生長［9］。盡管有關(guān)MT影響ES細(xì)胞增殖與分化的文獻(xiàn)數(shù)量有限，但是通過上述報(bào)道可確定MT 對ES細(xì)胞的增殖具有明顯的調(diào)控作用。

3 褪黑激素與神經(jīng)干細(xì)胞

MT 屬于一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，它不僅通過血腦屏障（blood－brain barrier，BBB）進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還能當(dāng)BBB 損壞時(shí)，通過松果體凹槽直接進(jìn)入循環(huán)，從而影響神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSCs）是一種具有自我更新能力的成體干細(xì)胞，能夠向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞［10］、少突膠質(zhì)細(xì)胞［11］分化，但其增殖和分化受到環(huán)境、激素等多種因素調(diào)節(jié)。Fu J等［12］報(bào)道了MT 對缺氧條件下NSCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)100μmol／L的MT 不僅能夠增加NSCs數(shù)量，而且該濃度下的MT 也能夠促進(jìn)缺氧微環(huán)境下NSCs的增殖。對其分子機(jī)制探討后發(fā)現(xiàn)，缺氧微環(huán)境下NSCs MT 受體MT1 的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著升高；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）磷酸化的ERK1／2明顯增強(qiáng)；加入MT 受體拮抗劑Luzindole后，ERK1／2 的磷酸化顯著降低，最終證實(shí)MT 結(jié)合其受體MT1在缺氧條件下經(jīng)過ERK1／2信號通路來調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。有學(xué)者從成年小鼠腦室下區(qū)獲得NSCs并探討不同濃度MT 對其增殖的影響，發(fā)現(xiàn)MT 處理后的NSCs獲得的神經(jīng)球數(shù)量增多，因而證明MT 可促進(jìn)NSCs 的增殖［13］。Song J等［14］研究MT 對NSCs的保 護(hù)功能發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的炎性環(huán)境下，100nmol／L 的MT 能夠抑制NSCs的凋亡，維持神經(jīng)球的大小；且SOX2、TLX 和 成 纖 維 細(xì) 胞 生 長 因 子2 型 受 體（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR－2）mRNA的表達(dá)顯著增加，表明在脂多糖誘導(dǎo)的炎性條件下，MT 能夠促進(jìn)NSCs的增殖，抑制其凋亡。進(jìn)一步研究了分子機(jī)制證實(shí)，脂多糖炎性微環(huán)境中MT 激活了PI3K／Akt／Nrf2信號，從而增加了NSCs的活性。MT 不僅影響NSCs的增殖，對其分化也有一定的 作用。Kong X Y 等［15］發(fā) 現(xiàn)，MT 能 夠 提 高 酪氨酸羥化酶（多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記物）的mRNA和蛋白表達(dá)水平；降低星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP的表達(dá)，從而證實(shí)MT 能夠誘導(dǎo)NSCs向多巴胺神經(jīng)細(xì)胞分化而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成。由此可見，MT 對NSCs的增殖與分化具有十分重要的作用。因此，深入了解MT 對NSCs增殖與分化的作用機(jī)制并開展大量的臨床試驗(yàn)，將會(huì)為神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

4 褪黑激素與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose－derived stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離出的一類間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅具有自我更新的能力，在特定的條件還可以向骨［16］、軟骨［17］、心?。?8］等多種終末細(xì)胞分化。近幾年報(bào)道ADSCs與MT 聯(lián)合應(yīng)用可以影響ADSCs的增殖與分化。Zaminy等研究MT 對ADSCs增殖與分化的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MT（0.01 nmol／L～10 nmol／L）處理后，ADSCs的活性急劇減弱，細(xì)胞數(shù)量顯著降低，表明MT 抑制了ADSCs的增殖，促進(jìn)其凋亡。同時(shí)，將MT 與成骨誘導(dǎo)液混合作用ADSCs后發(fā)現(xiàn)，ADSCs內(nèi)鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量比對照組明顯減少，且堿性磷酸酶的活性受到抑制，說明MT 抑制ADSCs向成骨細(xì)胞分化。表明MT 促進(jìn)了ADSCs的凋亡，阻止了其向成骨細(xì)胞的分化［19］。陳嘉等［20］研究MT 對ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)1.0μmol／L和0.1μmol／L 的MT 誘導(dǎo)ADSCs第8天時(shí)，血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE－Cadherin，VE）的陽性表達(dá)率可達(dá)40%～50%，并且可形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明MT 可有效促進(jìn)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸升高，p－ERK 蛋白表達(dá)顯著增加，證實(shí)MT 通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，激活ERK／MAPK 信號通路促進(jìn)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。ADSCs具有來源廣泛、取材方便等優(yōu)勢而且為避免免疫排斥可以實(shí)現(xiàn)自體移植，目前已成為組織工程中最理想的種子細(xì)胞之一，而ADSCs在體外有效的增殖和分化是其應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。分析以上報(bào)道可知，MT 不僅能夠影響ADSCs的增殖而且可以調(diào)控ADSCs的分化。

5 褪黑激素與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定的條件下能夠向骨、軟骨［21］、神經(jīng)［22］等細(xì)胞分化。然而，BMSCs移植后在體內(nèi)微環(huán)境中極易發(fā)生凋亡，影響了BMSCs修復(fù)組織損傷的效果。因此，提高植入BMSCs的存活率和降低凋亡率成為BMSCs臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。Wang F W 等［23］研究了MT 對過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)MT（1、10、100nmol／L）預(yù)處理BMSCs 30min后，可有效抵抗過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡，并證實(shí)MT 是通過抑制P38MAPK 信號途徑發(fā)揮作用。最近有研究者報(bào)道了MT 在缺氧環(huán)境下對BMSCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)200nmol／L 的MT 不僅提高BMSCs 的活性，而且能夠促進(jìn)缺氧條件下BMSCs的增殖。對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧微環(huán)境中，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生受到抑制，Bax／Bcl－2蛋白表達(dá)率得到增加，線粒體膜電位減弱，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）被 激 活。由 此 證 明MT 經(jīng) 由ERK1／2和p38信號通路促進(jìn)移植的BMSCs存活，提高細(xì)胞生存能力［24］。

6 褪黑激素與牙髓干細(xì)胞

Gronthos等首次報(bào)道在人牙髓組織中存在干細(xì)胞即牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。牙髓干細(xì)胞是繼多種成體干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)之后又一種能夠向多種細(xì)胞分化的成體干細(xì)胞。研究已經(jīng)證明DPSCs能夠向神經(jīng)［25］、脂肪、骨骼［26］等細(xì)胞分化。Cho等探討MT 對DPSCs向肝細(xì)胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的DPSCs加入肝性誘導(dǎo)劑（hepatogenic medium，HM）培 養(yǎng)21d 時(shí)，添 加MT（0.1 μmol／L～10μmol／L）后，白蛋白（albumin，Alb）、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）、C／EBPα 和 肝 細(xì) 胞 核 因 子（hepatocyte nuclear factor，HNF）的表達(dá)顯著提高；DPSCs分化肝細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng)，表明MT能夠促進(jìn)HM 誘導(dǎo)DPSCs向肝細(xì)胞分化。對其作用機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（bone morphogenetic protein 2，BMP－2）的表達(dá)增強(qiáng)，Smad1／5／8的表達(dá)受到抑制，進(jìn)而證明MT通過BMP、p38、ERK和NF－κB信號通路實(shí)現(xiàn)調(diào)控DPSCs向肝細(xì)胞分化。同時(shí)，研究者利用CCL4建立體外肝纖維化模型，探討MT 和DPSCs聯(lián)合應(yīng)用對肝纖維化的治療作用。與對照組比較，MT和DPSCs聯(lián)合移植入肝纖維化小鼠體內(nèi)后，肝纖維化受到抑制，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和氨的水平得到恢復(fù)。進(jìn)而證明MT 能夠促進(jìn)DPSCs治療CCL4引起的肝纖維化［27］。目前，尚未發(fā)現(xiàn)MT 影響DPSCs增殖相關(guān)的報(bào)道，但是上述文獻(xiàn)充分肯定了MT 能夠調(diào)控DPSCs向肝細(xì)胞分化。由此，臨床中應(yīng)用DPSCs治療肝臟相關(guān)的疾病時(shí)可以考慮MT在其中的作用。

7 結(jié)語

綜上所述，MT 對ES細(xì)胞、NSCs、ADSCs、BMSCs和DPSCs增殖與分化具有重要的調(diào)控作用，其作用機(jī)制的復(fù)雜性越來越受研究者們的關(guān)注。今后需進(jìn)一步探討和研究MT 與干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用的作用效果，發(fā)現(xiàn)和闡明MT 作用后的機(jī)制，為提高干細(xì)胞移植修復(fù)組織損傷提供參考。

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