茍體忠，唐文華，任永權(quán)，孫大方，許西華

(1.凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;3.凱里學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州凱里 556011;4.環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州凱里 556011)

?

石吊蘭總多酚體外抗氧化活性研究

茍體忠1,2,3，唐文華1,3，任永權(quán)4，孫大方1，許西華1

(1.凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;3.凱里學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州凱里 556011;4.環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州凱里 556011)

研究石吊蘭總多酚的體外抗氧化活性。采用單因素實驗研究提取時間、超聲波功率、提取溫度、乙醇濃度、提取次數(shù)和料液比對總多酚提取率的影響。用還原能力、·OH 清除率、DPPH·清除率來考察石吊蘭總多酚的體外抗氧化活性。結(jié)果表明,超聲提取石吊蘭總多酚的最佳工藝條件為:提取時間32min,超聲波功率為100%,提取溫度為25℃,乙醇濃度為80%,提取次數(shù)為3次,液料比為20∶1,此時石吊蘭總多酚得率為14.0mg GAE/g。此外,石吊蘭總多酚的還原能力、對·OH以及DPPH· 的清除均高于VC。石吊蘭總多酚是天然的抗氧化活性劑和自由基清除劑。

石吊蘭,總多酚,抗氧化活性

石吊蘭為苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔屬植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maximl)的全草[1],又名石豇豆、石澤蘭、巖豇豆等,具有清肺止咳、涼血止血、祛濕化滯、通絡(luò)止痛之功效。石吊蘭主要分布于貴州、云南、四川、江蘇、廣西等地。前人已對石吊蘭進行了一系列研究,并得出了以下結(jié)論:石吊蘭醇提液對S180 實體瘤有一定的抑瘤作用,其抑瘤率為42.1%[2];石吊蘭中的石吊蘭素是治療結(jié)核病的有效成分[3];首次從石吊蘭全草中分離出新的菖蒲烷類倍半萜類化合物3,10-dihydroxyacoronene[4];石吊蘭中含有生物堿、黃酮類化合物、石吊蘭素和B-谷甾醇等化合物[5]。

總多酚是多羥基酚類化合物的總稱,具有抗癌、抗病毒、抗氧化等生物活性[6-9]?？寡趸允侵参锟偠喾拥囊粋€重要性質(zhì),其抗氧化活性能力與多酚類物質(zhì)的含量及種類有關(guān)[8]?？偠喾油ㄟ^提供質(zhì)子,消除自由基,自身形成穩(wěn)定的共振結(jié)構(gòu)而阻斷氧化產(chǎn)生抗氧化作用,是醫(yī)藥、食品、化妝品中很有前景的一類天然抗氧化劑[9]。目前,石吊蘭總多酚抗氧化活性的研究尚未見報道。因此,本文采用還原能力、羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率來考查石吊蘭總多酚的抗氧化活性,從而為石吊蘭的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石吊蘭于2013年10月采自凱里市雷公山,經(jīng)凱里學(xué)院植物學(xué)博士鑒定為苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔屬植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maxim1)的全草。

三氯乙酸、沒食子酸、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、Folin&ciocalteu’s 酚試劑為aladdin試劑。其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計 UV-2550,島津;植物粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司;水浴振蕩器 SHA-C型,鞏義予華儀器有限公司;超聲波 WH-300,濟寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司;低速離心機TD5M,長沙湘智離心機儀器有限公司;電子天平 上海衡平儀器儀表廠。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品處理 石吊蘭樣品于80 ℃烘箱中干燥,再用植物粉碎機粉碎并過80目篩,待用。

1.3.2 提取時間選擇 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個50mL離心管中,在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%和提取溫度為30℃的條件下,分別超聲提取4、8、16、32、64min,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.3 超聲波功率的選擇 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個50mL離心管中,在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、提取溫度為30℃和提取時間為32min的條件下,分別以40%、50%、60%、80%、100%的超聲波功率提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.4 提取溫度的選擇 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個50mL離心管中,并在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%、提取時間為32min的條件下,分別以20、40、60、80、100℃水溫提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.5 乙醇濃度的選擇 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于8個50mL離心管中,并在料液比為1∶20、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%、提取溫度為30℃和提取時間為32min的條件下,分別用 30%、40%、50、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.6 提取次數(shù)對石吊蘭總多酚含量的影響 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個50mL離心管中,并在料液比為1∶20、超聲波功率為100%、乙醇濃度為80%、提取溫度為30℃和提取時間為32min的條件下,分1、2、3、4、5次提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.7 料液比的選擇 分別準(zhǔn)確稱取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個50mL離心管中,并在超聲波功率為100%、乙醇濃度為80%、提取溫度為30℃、提取次數(shù)為3次和提取時間為32min的條件下,分別用料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測定其總多酚的含量。

1.3.8 總多酚測定 總多酚含量的測定參照文獻[10]并稍作修改。其簡要流程為:準(zhǔn)確稱取0.125 g沒食子酸用超純水定容至1000mL。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5mL于6個25mL比色管中,先加超純水至10mL,搖勻,再加入Folin-Ciocalteu(FC)酚試劑1.0mL,混勻,然后加入6.0mL 10%Na2C03溶液,并用超純水定溶至刻度,搖勻。然后在暗室中放置2h,并于760nm波長下測定其吸光度。以沒食子酸濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為:A=0.0838C+0.0067(r=0.9999)。取石吊蘭提取液0.2mL于25mL比色管中,按上述步驟測定其吸光度,再根據(jù)回歸方程計算石吊蘭提取液總多酚的濃度,并以此計算其多酚含量,以每克樣品中沒食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/g)。

1.3.9 醇提物還原能力測定 還原能力的測定方法參照文獻[11],其簡要流程為:取1mL不同濃度的提取液,并依次加入2.5mL的 pH6.6 的磷酸鹽緩沖液和1%(m/v)鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液,搖勻并置于50℃水浴振蕩器中振蕩20min。然后加入2.5mL 10%(m/v)三氯乙酸溶液,搖勻并取混液 2.5mL,再加入2.5mL 超純水以及0.1%(m/v)氯化鐵溶液,搖勻并靜置10min,在 700nm處測定吸光度(As),以超純水代替提取液作為空白并測定其吸光度 Ac。則還原能力可以用ΔA來表示(ΔA=As-Ac),其值越大,提取液還原能力越強。

1.3.10 ·OH清除率的測定 ·OH清除率的測定方法參照文獻[11],其簡要流程為:在25 mL比色管中依次加入4mL pH7.4磷酸鈉緩沖液以及1.5mL 5mmol/L鄰二氮菲溶液、1mL 7.5mmol/L FeSO4溶液、1.5mL雙蒸水,搖勻,再加入1mL不同濃度的提取液,立即搖勻。然后加入1mL 1%(v/v)H2O2溶液,搖勻并置于37℃恒溫水浴中恒溫60min。最后,在536nm處測定其吸光度。根據(jù)下式計算樣品對·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A1-A2)/(A0-A2)]×100

其中:A1為加入提取液及H2O2時測得的吸光度;A2為加 H2O2而不加提取液時測得的吸光度;A0為不加提取液及 H2O2時測得的吸光度。

1.3.11 DPPH·清除率測定 DPPH·清除率的測定方法參照文獻[12],其簡要流程為:在25mL比色管中依次加入2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液和2mL不同濃度的提取液,搖勻,并在暗室中放置30min,以無水乙醇為參比液,在517nm下測定其吸光值A(chǔ)s,同時測定2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)c。根據(jù)下式計算樣品溶液對DPPH·的清除率:

DPPH·清除率(%)=(1-As/Ac)×100

1.3.12 數(shù)據(jù)處理方法 文中數(shù)據(jù)和圖表分別采用Excel、coreldraw12軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 石吊蘭不同極性試劑提取液清除DPPH·的能力

從圖1可見,石吊蘭不同極性試劑提取液對DPPH·的清除能力存在明顯差異,其大小順序為:乙醇>正丁醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚。由此可知,乙醇提取液具有較高的清除DPPH·的能力。因此,以下實驗均以乙醇提取液為考察對象。

2.2 石吊蘭總多酚提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取時間對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2A可見,隨著超聲時間的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)超聲時間為32min時,其總多酚含量達到最大值。

圖1 不同提取液對DPPH·清除率的影響Fig.1 Effection of the different extraction solution on DPPH· scavenging rate

2.2.2 超聲波功率對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2B可見,隨著超聲波功率的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)超聲波功率為100%時,其總多酚含量達到最大值。

2.2.3 提取溫度對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2C可見,在20～80℃的水溫條件下,石吊蘭總多酚含量幾乎保持不變。分析認(rèn)為,提取水溫對石吊蘭總多酚的含量影響不顯著,只需在室溫(25℃)下提取即可。

2.2.4 乙醇濃度對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2D可見,隨著乙醇濃度的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)乙醇濃度為80%時,其總多酚含量達到最大值。

2.2.5 提取次數(shù)對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2E可見,隨著乙醇濃度提取的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)提取次數(shù)為3次時,其總多酚含量達到最大值且開始保持不變。

通過不斷地實踐與改革，得到了較好的結(jié)果。《臨床血液學(xué)檢驗技術(shù)》的教學(xué)改革多次被領(lǐng)導(dǎo)提及，并受到了學(xué)生們的一致好評，同學(xué)們的綜合成績也有所上升。

2.2.6 料液比對石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2F可見,隨著料液比的增加,其總多酚含量有所增加,當(dāng)料液比達到1∶20時,其總多酚含量達到最大值,并保持恒定值。

2.3 石吊蘭總多酚含量

取石吊蘭乙醇提取液,在波長760nm處測定其吸光度,代入1.3.8的回歸方程計算其多酚含量為14.0mg GAE/g。

2.4 石吊蘭總多酚的還原能力

以VC為對照樣品,分別測定石吊蘭總多酚和VC的還原能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚和VC與還原能力之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9774和0.9944)。分析認(rèn)為,石吊蘭中抗氧化活性成分可能是有總多酚含量決定的。國外學(xué)者研究也表明,含有高水平總多酚的植物表現(xiàn)出很好的體外抗氧化活性[13]。從圖3可見,隨著濃度的的增加石吊蘭總多酚以及VC還原能力增加,且石吊蘭總多酚的還原能力略高于VC。研究表明,石吊蘭多酚具有較強的還原能力。

圖2 提取條件對石吊蘭總多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction conditions on content of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl

圖3 不同濃度石吊蘭總多酚對還原能力的影響Fig.3 Effect of the different concentration on reducing power from Lveicnotus pauciflorus Maximl

2.5 石吊蘭總多酚清除·OH的能力

以VC為對照樣品,分別測定石吊蘭總多酚和VC清除·OH的能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚與VC對·OH的清除率之間存在明顯正相關(guān)關(guān)系(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9241)。分析認(rèn)為,石吊蘭醇提物清除·OH的活性主要是由總多酚成分決定的。由圖4可見,石吊蘭總多酚對·OH的清除能力高于VC,這表明石吊蘭總多酚具有較好的清除·OH的能力。

圖4 不同濃度石吊蘭總多酚對 ·OH清除率的影響Fig.4 Effect of the different concentration on OH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊蘭總多酚和VC濃度(X)對·OH的清除率(Y)作回歸分析。石吊蘭總多酚對·OH的清除率的回歸方程為:Y=0.0865X+2.9626(r=0.9999)。VC對·OH的清除率的回歸方程為Y=0.0054X+2.787(r=0.9241)。分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚清除·OH的活性遠大于VC。

2.6 石吊蘭總多酚清除DPPH·的能力

以VC為對照樣品,分別測定石吊蘭總多酚和VC清除DPPH·的能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚對DPPH·和VC的清除率之間呈明顯正相關(guān)(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9989)。分析認(rèn)為,石吊蘭醇提物清除DPPH·的活性可能主要是由總多酚成分決定的。由圖5可見,隨著石吊總蘭總多酚和VC濃度的增加,其清除DPPH·的活性增加。分析認(rèn)為,石吊蘭總多酚具有很好的清除DPPH·的能力。

圖5 不同濃度石吊蘭總多酚對DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of the different concentration on DPPH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊蘭總多酚和VC濃度(X)對DPPH·的清除率(Y)作回歸分析。石吊蘭總多酚對DPPH·的清除率的回歸方程為:Y=3.0136X+0.8166(r=0.9989)。VC對DPPH·的清除率的回歸方程為Y=2.7698X+1.3694(r=0.9996)。分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚清除DPPH·的能力稍強于VC。

3 結(jié)論

研究表明,超聲提取石吊蘭總多酚的最佳工藝條件為:提取時間為32min,超聲波功率為100%,提取溫度為25℃,乙醇濃度為80%,提取次數(shù)為3次,液料比為20∶1,此時石吊蘭總多酚得率為14.0 mg GAE/g。此外,通過對石吊蘭總多酚的還原能力、DPPH·清除率、·OH清除率的分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚具有較強的還原能力,較高的·OH清除能力,以及較強的DPPH·清除能力。分析認(rèn)為,石吊蘭總多酚具有較強的體外還原活性,是天然的抗氧化活性劑。

[1]盛衛(wèi)國,熊陽,徐蓮英.正交設(shè)計優(yōu)選石吊蘭中石吊蘭素的提取工藝[J].中藥材,2008,31(11):1751-1753.

[2]胡曉,黃賢華,譚曉彬.石吊蘭醇提取液S180 實體瘤作用和對荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(16):3097-3099.

[3]孫利華.石吊蘭制劑治療頸淋巴結(jié)核32例[J].河北中醫(yī),2006,28(1):311.

[4]Wen QF,Zhong YJ,Su XH,et al.A new acorane sesquiterpene from Lysionotus pauciflorus[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2013,11(2):185-187.

[5]陳曉梅,康頤璞,司民真.石吊蘭的紅外光譜分析[J].光散射學(xué)報,2009,21(4):360-365.

[6]劉曼,韓升廷,張海悅,等花生紅衣粗多酚體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(2):120-122.

[7]Kolayli S,Aahin H Ulusoy E,et al.Phenolic composition and antioxidant capacities of Helichrysum plicatum[J].Hacettepe journal of biology and chemistry,2001,38(4):269-276.

[8]Petkovsek MM,Slatnar A,Stampar F,et al.The influence of organic/integrated production on the content of phenolic compounds in apple leaves and fluits in four different varieties over a 2-year period[J].Journal of the science of food and agriculture,2010,90(14):2366-2378.

[9]成喜雨,崔馨,劉春朝,等.中草藥抗氧化活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18:514-518.

[10]焦士蓉,馬力,黃承鈺,等.枳實提取物的體外還原作用研究[J].中藥材,2008,31(1):113-116.

[11]趙艷紅,李建科,趙維,等.常見藥食植物提取物體外還原活性的評價[J].食品科學(xué),2009,30(3):104-108.

[12]Gülcin I,Elmastas M,Aboul-Enein HY.Antioxidant activity of clove oil-A powerful antioxidant source[J].Arabian Journal of chemistry,2012,5:489-499.

[13]Shukla S,Mehta A,Bajpai VK.Antioxidant ability and total phenolic content of aqueous leaf extract of Stevia rebaudiana bert.[J].Experimental and Toxicological Pathology,2012,64:807-811.

Study on antioxidant activityinvitroof total polyphenolfrom Lveicnotus pauciflorus Maximl

GOU Ti-zhong1,2,3，TANG Wen-hua1,3，REN Yong-quan4，SUN Da-fang1，XU Xi-hua1

(1.Institute of Chemistry & Materials Engineering,Kaili University,Kaili 556011,China;2.Research center of selenium-riched Chinese Herbs,Kaili University,Kaili 556011,China;3.Institute of Applied Chemistry,Kaili University,Kaili 556011,China;4.Institute of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili 556011,China)

To study the antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl.The single factor was taken to study the effects of extraction time,ultrasonic power,extraction temperature,extraction times,and ethanol concentration liquid-material ratio on the extraction rate of total polyphenol.The antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was evaluated by reducing power,hydroxyl and DPPH free radical scavenging effect.The results showed that the optimum conditions for extracting the polysaccharides assisted by ultrasonic wave were as follows:extraction time 32min,ultrasonic power 100%,extraction temperature 25℃,extraction times 3,and ethanol concentration liquid-material ratio 20∶1,and the extraction rate of total polyphenol was up to 14.0mg GAE/g.In addition,the reducing power of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was more than VC,and the scavenging ability of DPPH· and ·OH was also stronger than VC.Total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl is an effective and natural antioxidant and free radical scavenger.

Lveicnotus pauciflorus Maximl;total polyphenol;antioxidant activity

2014-06-12

茍體忠(1981-)，男，博士，副教授，從事天然藥物化學(xué)研究。

國家青年自然科學(xué)基金(41303016)；貴州省科技廳自然科學(xué)基金(黔科合J字[2011]2079號)；凱里學(xué)院博士專項基金(BS201003)；貴州省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才計劃項目(黔教合KY字[2012]099號)；貴州省教育廳“高層次人才引進項目”(院科通[2012]7號)；凱里學(xué)院重點項目(Z1202)；貴州省特色重點學(xué)科資助項目(黔教高發(fā)[2011]208號)；凱里學(xué)院重點學(xué)科資助項目(院通字[2010]86號)；貴州省優(yōu)秀科技人才省長基金項目(黔省專合字[2011]77號)；凱里學(xué)院分析化學(xué)重點學(xué)科(院通字[2014]157號)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0073-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.006