王　艷，莊金秋，梅建國，姚春陽，沈志強（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

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禽偏肺病毒檢測方法研究進展

王艷，莊金秋，梅建國，姚春陽，沈志強
（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

摘 要：禽偏肺病毒病是嚴重危害家禽業(yè)的主要疾病之一。論文概述了禽偏肺病毒實驗室檢測方法的研究進展。在細胞生物學方面，主要依靠病毒分離培養(yǎng)、ELISA法等病毒特異性抗原及其抗體的檢測等。在分子生物學方面，主要依靠國內(nèi)外相繼建立起來的RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、LAMP和核酸雜交技術(shù)等。介紹和比較了各種方法的優(yōu)缺點和實用性，為臨床獸醫(yī)科技工作者使用快速、簡便、準確、實用的檢測方法提供參考。

關(guān)鍵詞：禽偏肺病毒；檢測；酶聯(lián)免疫吸附試驗；分子生物學方法

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV），又稱為火雞鼻氣管炎病毒（Turky rhinotracheits virus，TRTV），早期稱為禽肺病毒（Avian pneumovirus，APV）。aMPV屬于副黏病毒科、肺炎病毒亞科、偏肺病毒屬成員，是從人群中分離到人偏肺病毒（Human metapneumovirus，hMPV）后，被重新分類為禽偏肺病毒［1］。該病毒常引起以家禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降為主要特征的疾病，是侵襲家禽上呼吸道的一種高度傳染性病毒，可對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。aMPV感染火雞后可引起溫和或中度上呼吸道感染-火雞鼻氣管炎（Turky rhinotracheits，TRT）；感染肉雞可引起雞的溫和型上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病-肉雞腫頭綜合征（Swollen head sydrome，SHS）；感染產(chǎn)蛋雞可導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低等［2］。aMPV于1978年首次在南非報道之后，現(xiàn)已在世界許多國家都有分布。我國沈瑞忠等于1998年首次分離并報道了該病毒［3］。目前，aMPV分為A、B、C、D 4個亞型，其中A亞型和B亞型在世界各地均有報道，C亞型和D亞型分別在美國和法國有報道［4］。aMPV感染沒有特征性的臨床表現(xiàn)和病變，且常會與禽傳染性支氣管炎病毒、支原體、禽波氏桿菌、鼻氣管鳥桿菌和禽流感等呼吸道病原體相互混淆。試驗證明當aMPV與其他病原協(xié)同作用時可以加重和延長臨床癥狀并增加病死率。近年來，aMPV感染給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的動物福利問題，尤其是一些火雞飼養(yǎng)大國，從而引起許多國家的高度關(guān)注。目前對aMPV感染尚無有效的治療藥物和方法，因此，做好該病的預(yù)防控制，特別是快速而準確的診斷方法的建立受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。本文就aMPV檢測技術(shù)研究進展方面做一綜述，以期對禽偏肺病毒病的深入研究和疾病防控提供參考。

1　病毒分離與鑒定

病料多采集自感染aMPV病禽的氣管、肺臟以及眼鼻分泌物，或鼻竇、鼻甲刮下的組織。應(yīng)盡早對樣品進行采集并立即送檢，因為aMPV可能最多在鼻竇和鼻甲中存在6d～7d。用臨床癥狀較為嚴重的雞進行病毒的分離很少有成功的先例，一般認為臨床癥狀的出現(xiàn)是由aMPV感染后繼發(fā)感染其他病原微生物所導(dǎo)致的。

1.1雞胚培養(yǎng)

6日齡～8日齡SPF雞胚或火雞胚可用于病毒的分離。經(jīng)卵黃囊接種aMPV后第8d收集尿囊液和卵黃囊膜進行勻漿，接種繼代培養(yǎng)。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，胚胎發(fā)育受阻，胚體表面出血，甚至死亡。這種方法費時費力，需要連續(xù)傳代很多次才能穩(wěn)定的致死胚，而且往往分離病毒失敗。1980年，南非最早的aMPV毒株是采用這種方法得到的。C亞型的aMPV也是采用這種方法分離得到的［5］。

1.2氣管環(huán)培養(yǎng)

適合的病毒培養(yǎng)物首選為即將岀殼的SPF雞胚或火雞胚的氣管環(huán)，也可用無aMPV抗體的1日齡～2日齡的雛雞制作氣管環(huán)培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)物可以維持數(shù)周，接種樣品之后觀察纖毛運動的停滯，一般在aMPV感染1周后纖毛活動停滯。而觀察到恒定的病變時，還要繼續(xù)培養(yǎng)幾代。一些早期分離到的A亞型和B亞型aMPV都是通過用這種方法得到的。在氣管環(huán)培養(yǎng)（TOC）中，A和B亞型aMPV感染10d后造成纖毛活動停滯，但在接種后3d～5d里病毒滴度就達到高峰，因此野外材料在接種TOC后間隔3d～4d進行盲傳，每次盲傳后留一部分TOC用作纖毛運動活性檢查。但是，TOC并不適合C亞型病毒的分離，因其不能使纖毛運動停滯。有研究表明，利用TOC法培養(yǎng)，aMPV傳代98次后病毒的毒力仍沒有丟失。相比之下，aMPV在其他細胞上傳代，可迅速使病毒毒力致弱。因此，使用aMPV弱毒株作為疫苗，很可能出現(xiàn)毒力返強現(xiàn)象，從而引起免疫個體發(fā)病，甚至出現(xiàn)散毒的危險。

1.3細胞培養(yǎng)

aMPV可在多種原代和傳代系細胞內(nèi)增殖。最常用原代細胞有雞胚成纖維細胞（CEF）或火雞胚成纖維細胞（TEF）和雞胚肝細胞（CEL）；傳代系細胞有雞胚成纖維細胞（DF-1）和非洲綠猴腎細胞（Vero）等。鵪鶉成纖維細胞（QT-35）也曾被用于美國C亞型aMPV的早期分離。另外，Patnayak D P等［6］證明了aMPV也可在黑長尾猴腎細胞（BGM-70）、羅猴胎兒細胞（MA-104）、鼠源的麥科伊細胞（Mc-Coy）、幼倉鼠腎細胞（BHK-21）以及牛胚腎細胞（MDBK）等傳代細胞系上增殖。病毒在細胞中經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后可產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)（CPE），其特征是細胞分散、變圓，并有合胞體形成。該方法在病毒早期分離中不一定成功，需要盲傳多代才能出現(xiàn)一致的CPE。但是aMPV一旦適應(yīng)了在雞胚和TOC上生長，可在培養(yǎng)細胞上獲得高滴度的病毒，培養(yǎng)7 d內(nèi)可在細胞上呈現(xiàn)典型的合胞體CPE。對分離到的aMPV可通過電鏡或免疫化學方法作進一步鑒定。

2　免疫血清學方法

2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗

由于aMPV的分離鑒定比較困難，因此血清學方法常被用于商品家禽及其他禽類aMPV感染的診斷。血清學檢測方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是最常用的檢測方法之一，該法操作簡便，僅需要采集少量血清便可以對樣品進行快速、靈敏的檢測?，F(xiàn)在國外已經(jīng)有多種商品化和自主研制的aMPV抗體檢測試劑盒問世，為臨床監(jiān)測提供了有利的工具。該方法可以同時檢測大量的血清，有一些試劑盒甚至可以檢測多種禽源的不同亞型aMPV。然而，在使用許多試劑盒檢測不同亞型的aMPV時，敏感性和特異性方面卻沒有保證。主要原因是用來包被ELISA板的抗原變異和抗原不純。Hafez H M等［7］分別應(yīng)用3種不同的aMPV毒株作為包被抗原用于血清樣品檢測，從而對ELISA試劑盒的敏感性進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并不是所有的包被抗原都可以檢測到血清中的aMPV抗體。如果用異源毒株包被ELISA板，可能檢測不到由aMPV疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。加入A亞型或B亞型抗原的ELISA試劑盒對aMPV C亞型毒株抗體檢測不敏感。也就是說，一般情況下，當用異株aMPV作為包被抗原，即使通過病毒中和試驗出現(xiàn)很近的關(guān)系時，也不能很好的用于aMPV的抗體檢測。一些競爭性ELISA試劑盒加入了入aMPV特異性單克隆抗體，為不同禽種的血清檢測提供了可行性。然而，這種試劑盒不適用于C亞型aMPV美國分離株抗體的檢測。近期，包含aMPV科羅拉多州分離株（Colorado株）和明尼蘇達州分離株（Minnesota株）全病毒抗原的ELlSA試劑盒已經(jīng)被研制和評估，這些試劑盒通過表達的M蛋白和N蛋白建立的雙抗原夾心ELISA檢測C亞型的MPV的抗體更加敏感和特異。我國對aMPV的研究相對匱乏，陳琳等［8］將純化的B亞型aMPV重組G蛋白作為診斷抗原，建立了檢測B亞型aMPV抗體的間接ELISA檢測方法。該方法具較高的特異性和較好的可重復(fù)性，與IDEXX司生產(chǎn)的aMPV抗體檢測試劑盒符合率為96.0%，可用于aMPV的血清學檢測。應(yīng)用該方法對山東省部分地區(qū)的商品蛋雞、商品肉雞和肉種雞進行血清學檢測，表明aMPV感染在山東省部分地區(qū)的雞群中是廣泛存在的，且以肉種雞的陽性率為最高，商品蛋雞陽性率最低。這一研究為aMPV診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)，并為該病的診斷與流行病學調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。贠炳嶺［9］建立了檢測aMPV抗體的間接ELISA方法，該方法與IDEXX同類ELISA試劑盒符合率為97.01%，適用aMPV的血清學調(diào)查和臨床樣品檢測。

2.2病毒中和試驗

可以應(yīng)用敏感的細胞培養(yǎng)和TOC同時結(jié)合標準的病毒中和試驗對aMPV抗體進行檢測。A亞型和B亞型aMPV可以發(fā)生交叉反應(yīng)。病毒中和試驗（VN）耗時、昂貴，不適合禽場的大規(guī)模血清學篩選。

2.3免疫熒光試驗（IFA）

熒光抗體檢測是一種非常好的檢測方法，已經(jīng)有很多相關(guān)報道，如Naylor C J等［10-11］，但是該方法并不適用于大量血清樣品中aMPV抗體的檢測。

2.4乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗具有快速、簡便、準確、特異性強、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點，是一種適于基層單位檢測aMPV的可靠方法。裴蘋蘋等［12］建立了aMPV乳膠凝集試驗檢測方法并將其用于臨床病料的檢測。aMPV抗體致敏乳膠無自凝性、特異性強、質(zhì)量穩(wěn)定、檢測結(jié)果可靠，為aMPV的快速診斷提供了一種簡單、有效的方法。

3　分子生物學方法

3.1RT-PCR技術(shù)

RT-PCR技術(shù)是檢測aMPV的常用方法。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測時需要充分考慮當?shù)氐牧餍衼喰?，以便為是否需要設(shè)計亞型特異性引物提供參考。例如，在歐洲有4種亞型，同時在美國就只有一種C亞型。通常以F、G和M基因作為目的基因建立的RT-PCR方法，不能用于檢測所有的亞型。而針對N基因的保守區(qū)設(shè)計引物建立的RT-PCR方法，能夠檢測A、B、C和D四個亞型。陽性樣品可以進一步通過亞型特異性引物、序列分析和限制性片段長度分析等確定其亞型。Woade A A等［13］利用RT-PCR方法對我國南方部分地區(qū)A亞型aMPV的感染率進行統(tǒng)計，陽性檢出率高達39%，但是B亞型為陰性。Ongor H M等［14］利用RT-PCR方法對土耳其火雞進行檢測，陽性檢出率為2.9%。陳琳等［15］根據(jù)B亞型aMPV F基因的保守序列設(shè)計引物，建立了針對B亞型aMPV的RT-PCR檢測方法。應(yīng)用該方法對山東省492份具有呼吸道癥狀的商品肉雞的肺臟病料進行檢測，結(jié)果aMPV陽性檢出率為43.09%（212/492），隨機挑取11份進行克隆測序及序列分析，結(jié)果顯示所擴增到的陽性產(chǎn)物均為B亞型aMPV。這表明了aMPV在山東省商品肉雞群中普遍存在，且陽性率較高，應(yīng)該引起足夠的重視。薛聰?shù)龋?6］建立了一種適用于B亞型aMPV的套式RT-PCR檢測方法。應(yīng)用本方法對采自山東省不同地區(qū)的64份可疑臨床病料進行檢測，陽性檢出率為57.8%（37/64）。其所建立的套式RTPCR檢測方法具有特異、敏感、實用等優(yōu)點，為B亞型aMPV的快速診斷以及深入研究提供了更加可靠的方法。

3.2熒光定量RT-PCR技術(shù)

熒光定量RT-PCR技術(shù)比常規(guī)的RT-PCR靈敏度更高、特異性更強，穩(wěn)定性更好，尤其適用于病毒感染的早期診斷。Guionie A O等［17］報道，實時熒光定量RT-PCR可作為aMPV檢測的強有力的工具，用于aMPV各亞型的鑒定和量化。Kwon J S等［18］利用實時熒光定量方法對韓國A亞型和B亞型aMPV進行檢測，結(jié)果商品肉雞、肉種雞和蛋雞的陽性檢出率分別為2.6%、3.8%和1%。鞠小軍［19］利用RT-PCR擴增出B亞型aMPV F基因的目的片段，并將其導(dǎo)入克隆菌中制備出陽性標準品，建立了B亞型aMPV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法。該方法具較高的特異性、靈敏度和較好的可重復(fù)性，可用于B亞型禽偏肺病毒的臨床樣品檢測。王麗榮等［20］建立了針對A、B和C 3個亞群aMPV的熒光定量RT-PCR方法，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，適用于病原學檢測，該方法為該病的早期診斷以及感染程度的定量分析奠定了基礎(chǔ)。熒光定量RT-PCR檢測aMPV的方法不僅能進行定性檢測，更能準確定量，這就為aMPV感染、增殖規(guī)律的研究及病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

3.3核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是一種易于判定結(jié)果的分子生物學診斷技術(shù)，它是一種基于分子雜交技術(shù)的檢測方法，可以檢測核酸樣品中是否存在特定目的基因。這種方法特異性較強，不需要特殊的儀器，適用于大量樣品的檢測，而且結(jié)果便于觀察。目前常使用的探針標記方法包括放射性同位素法、光敏生物素法、地高辛標記法等。孫靜等［21］利用地高辛標記的核酸探針對山東部分地區(qū)臨床健康肉雞群的多種呼吸道病原進行檢測，aMPV檢出率高達36.87%，而且多重感染現(xiàn)象比較嚴重，由此造成的損失難以估計。陳琳等［22］根據(jù)B亞型aMPV的F基因保守序列設(shè)計引物并用地高辛標記，制備出了地高辛標記的aMPV核酸探針。應(yīng)用制備的探針對山東省不同地區(qū)的605份商品肉雞和122份商品肉鴨進行了核酸探針檢測，陽性檢出率分別為36.59%和34.51%。表明aMPV在山東省商品肉雞及肉鴨中普遍存在，且陽性率較高。核酸探針技術(shù)特異性強，敏感性好，但是該法操作較為繁瑣，且不能對核酸進行進一步研究和探索。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）

RT-LAMP技術(shù)具有快速、準確、特異性強、靈敏度高的特點，可應(yīng)用于疾病的臨床診斷。鞠小軍［19］針對B亞型aMPV的F基因的保守區(qū)序列設(shè)計RT-LAMP引物，建立了B亞型aMPV的RT-LAMP檢測方法。利用該方法對20份疑似aMPV樣品進行檢測，其陽性檢出率為10%。結(jié)果顯示，該方法具有較高的靈敏度和特異性，可用于B亞型aMPV的臨床樣品檢測。RT-LAMP技術(shù)在B亞型aMPV的快速檢測和防治方面發(fā)揮一定的作用，為aMPV的檢測及疾病流行病學調(diào)查提供了可靠方法。

4　小結(jié)

目前，aMPV感染火雞和雞導(dǎo)致的疾病已成為危害世界許多國家和地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。特別是在火雞養(yǎng)殖業(yè)，由aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，造成巨大的經(jīng)濟損失。aMPV作為家禽呼吸道病原體之一，在國外受到了高度的關(guān)注，尤其是一些火雞飼養(yǎng)大國，但是在國內(nèi)的研究卻相對滯后。郭龍宗等［23］對我國等膠東地區(qū)不同周齡種雞群的血清，通過aMPV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)在膠東種雞群中普遍存在禽肺病毒感染，多個雞群血清學達到100%的陽性率，雞群普遍在開產(chǎn)前已經(jīng)感染該病，最早的感染時間在6周齡～12周齡。徐仕忠等［24］通過對aMPV流行病學研究的文獻資料及部分雞群aMPV感染的血清學調(diào)查結(jié)果進行分析，結(jié)果證實，aMPV感染已經(jīng)在中國的雞群中廣泛流行。在臨床上，雖然單純aMPV感染雞不一定表現(xiàn)明顯癥狀，但可以加重其他病原因子所致腫頭、呼吸道病和產(chǎn)蛋下降等問題的嚴重程度并增加病死率。aMPV的感染也可造成全身性免疫抑制反應(yīng)aMPV感染家禽后，常伴隨著細菌的繼發(fā)性感染，可使病死率增加25%～40%，對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前，疫苗接種和嚴格的生物安全手段是控制aMPV疾病的主要措施，但現(xiàn)有疫苗的安全性和有效性仍有待于進一步提高。因此加強對該病毒的研究，建立有效的診斷方法，是預(yù)防和控制該病的有效措施之一。對預(yù)防該病的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失，保護和促進養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。目前針對aMPV已建立了多種檢測方法，這些方法的使用極大的方便了該病的及早診斷，使得疫情得以有效控制。然而這些方法各自存在不同的優(yōu)缺點或苛刻要求，如有的存在操作繁瑣、受檢測材料限制、有的試驗周期較長、有的對試驗儀器及檢測人員技術(shù)要求高等，這就需要實驗室檢測人員根據(jù)各自條件，綜合選擇并建立合適的檢測方法，及時、準確、快速地監(jiān)測疾病進行的發(fā)生、發(fā)展和流行，并提供有效的防控措施。另外，隨著分子生物學的發(fā)展和人們對aMPV研究的不斷深入，相信不久的將來，更多更為高效、敏感、特異、快速、簡易而且價廉的檢測方法將會被建立起來。

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Progress on Detection Methods of Avian Metapneumovirus

WANG Yan，ZHUANG Jin-qiu，MEI Jian-guo，YAO Chun-yang，SHEN Zhi-qiang
（Shandong Binzhou Animal Science &Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong，256600，China）

Abstract：Avian metapneumovirus（aMPV）disease is one of the main infectious diseases，which is seriously harmful to poultry industry.The laboratory methods for detecting aMPV were summarized in this paper. In the cell biology aspect，the detection of aMPV mainly depends on virus isolation and culture，specific antigen and antibody examination such as ELISA.In the molecular biology aspect，the detection methods mainly depend on RT-PCR and real-time RT-PCR，LAMP and nucleic acid hybridization.The advantages and disadvantages，and the practicality of the several of methods were introduced and compared.It can provide references for use of rapid，simple，accurate and practical methods to detect avian metapneumovirus.

Key words：Avian metapneumovirus；detection；ELISA；moleoular biology method

作者簡介：王 艷（1976-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，助理研究員，主要從事獸醫(yī)微生物研究及動物用疫苗研制。

收稿日期：2014-10-16

中圖分類號：S852.657

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0130-05