魏林，梁志懷，張屹，肖姬玲，呂剛，3

（1.湖南省植物保護研究所，長沙，410125；2.湖南省西瓜甜瓜研究所；3.中南大學研究生院隆平分院）

1 水生蔬菜真菌病害癥狀觀察和發(fā)病程度調(diào)查方法

1.1 癥狀觀察

在田間對目標水生蔬菜真菌病害進行癥狀觀察時，都遵循方中達先生所述的先片后點的原則。即先觀察病害在全田發(fā)生的普遍性和嚴重度，病害發(fā)生的中心區(qū)及在田間發(fā)展分布，發(fā)生時期以及植株受害部位；然后觀察病害對整個植株的為害情況，包括是否出現(xiàn)腐爛、萎蔫、萎縮、畸形及生長習性的改變等；最后觀察出現(xiàn)典型癥狀的部位。

在針對由真菌所引起的水生蔬菜的葉斑病和斑點病等，調(diào)查時除觀察病斑形狀、大小、顏色、受害部分正反面（如葉面及葉背）癥狀、病斑上是否出現(xiàn)霉狀物或小黑點或輪紋等孢子和子實體病征外，還需留意癥狀初始狀態(tài)，及至發(fā)病后期的癥狀。本文采用的方法是發(fā)現(xiàn)初始癥狀后，定點固定幾片葉，掛上標簽。隨后的一段時期，定時定點觀察病害在葉片上癥狀發(fā)展情況，這樣做既確定了該病害發(fā)生后期的為害癥狀，又獲得了該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

1.2 發(fā)病程度調(diào)查的分級標準、病原菌致病性等級及品種抗性等級的劃分

在水生蔬菜葉部病害發(fā)生程度調(diào)查、室內(nèi)人工接種病原菌測定其致病性和寄主抗病性，以及對水生蔬菜各真菌性葉斑病等病害進行田間藥劑防治試驗時，都需要一個病害調(diào)查的分級標準。根據(jù)各病害的發(fā)生特點，制定了相應(yīng)的田間葉部病害調(diào)查分級標準，室內(nèi)菌絲塊人工接種時藕塊發(fā)病調(diào)查分級標準，以及蓮藕腐敗病實生苗人工接種發(fā)病調(diào)查分級標準。實際應(yīng)用表明，所制定的分級標準可以很好的區(qū)分植株的受害程度，進而鑒定出病原菌菌株間致病性的差異及寄主間抗病性的差異。具體的分級標準如下。

①發(fā)病程度調(diào)查的分級標準 在田間進行蓮藕葉部病害發(fā)生程度及田間藥效防治試驗時，制定的調(diào)查葉片發(fā)病程度分級標準為：0 級:葉片無病斑；1 級：病斑面積占整片葉面積的10%以下；3 級：病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5 級：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7 級：病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9 級：病斑面積占整片葉面積的75%以上。

②病原菌致病性等級劃分 在接種新鮮藕塊依據(jù)發(fā)病藕塊的病情程度來判斷蓮藕腐敗病菌和不同菌株的致病力強弱時，制定的調(diào)查藕塊發(fā)病程度分級標準為：0 級：藕塊生長正常、完好；1 級：藕塊表面有輕微病變，病變尚未侵及藕塊體內(nèi)組織；2 級：藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%以下；4 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%～30%；5 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的30%以上，每個藕塊為一計量單位。依據(jù)調(diào)查分級的結(jié)果，計算病情指數(shù)：病情指數(shù)=∑（各級藕塊數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總藕塊數(shù)×5）×100；再依據(jù)病情指數(shù)，按如下等級劃分腐敗病病原菌致病力的強弱：病情指數(shù)＞70，表示強致病力；30≤病情指數(shù)≤70，表示中致病力；病情指數(shù)＜30，表示弱致病力；病情指數(shù)為0，表示無致病力。

③品種抗性等級劃分 在進行蓮藕腐敗病實生苗人工接種測定品種抗病性時，制定的調(diào)查葉片發(fā)病程度分級標準為：0 級：植株葉片未見任何發(fā)病癥狀；1 級：葉片僅葉緣出現(xiàn)零星病斑，病斑面積不超過葉該葉片總面積的5%；2 級： 病斑沿葉緣連片，并向葉片中心發(fā)展，病斑面積占該葉片總面積的5%～20%；3 級：病斑面積占該葉片總面積的21%～40%；4 級：病斑面積占該葉片總面積的41%～60%；5 級：病斑面積占該葉片總面積的61%～80%；6 級：病斑面積占該葉片總面積的81%～100%，葉片褐腐死亡。蓮不同品種對腐敗病的抗性評價根據(jù)病情指數(shù)分成6 個等級：高抗≤10；10＜抗病≤20；20＜中抗≤40；40＜中感≤60；60＜感病≤80；80＜高感≤100。

2 病原菌菌絲體和子實體直接鏡檢的方法

由病原真菌引起的水生蔬菜病害，在其發(fā)病部位會有明顯的病征，可以利用這一點，在田間應(yīng)用放大鏡、 室內(nèi)應(yīng)用顯微鏡在分離病原物前進行檢查，觀察植株發(fā)病部位附著的真菌菌絲體和其他營養(yǎng)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)和著生方式、子實體形態(tài)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生部位等，從而對病原物先有初步的了解。在此過程中，常用的方法有3 種。

①當植株發(fā)病部位出現(xiàn)明顯的黑點（孢子體）、菌絲體、菌核等病征時，最簡單的方法就是接種針直接挑取這些特征物，放在加有一滴無菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。

②當植株發(fā)病部位出現(xiàn)的是如黑粉、白粉和其他霉狀物時，則可以用小片透明膠帶，貼在這些真菌體的部位，然后將沾有真菌的膠帶放在載玻片上，于顯微鏡下觀察。

③對于由鏈格孢或子囊菌等引起的病征十分明顯的病害，還可以用尖細的鑷子撕取透明的小塊受害部位寄主組織，直接放在載玻片上于顯微鏡下觀察。

3 病害病原菌單孢純化培養(yǎng)方法

蓮藕、茭白等水生蔬菜真菌病害的病原菌，在普通的PDA 培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力均較強。利用這一特點，可以應(yīng)用簡易的稀釋涂板挑單孢，對目標菌株進行純化。具體操作是：將病組織分離獲得微生物，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至大量產(chǎn)孢，在無菌條件下，挑取0.5 cm×0.5 cm 的菌絲塊，放置裝有1 mL無菌水的離心管中，搖動片刻后，再吸取100 μL 轉(zhuǎn)至下一離心管中，然后用稀釋到適宜濃度的離心管中的孢子懸浮液進行PDA 平板涂布，可獲得分離度很好的單孢菌落群。

4 用科赫氏法則驗證病原菌的方法

4.1 病原菌鑒定的回接方法

對病原菌進行確定時，遵循科赫氏法則，需進行回接驗證?；亟訒r的接種方法，因病原菌侵染的部位不同也有所不同。在對蓮藕腐敗病病原菌進行研究時，篩選強致病性菌株時，選取的是新鮮藕塊接種方法：經(jīng)過分離純化和分子鑒定的供試鐮刀菌菌株用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6 d，取嫩藕節(jié)6～8 cm長的中間段，縱剖切取獲得用于接種的藕塊；用直徑為5～7 mm 無菌打孔器自菌落的邊緣打取菌餅，菌餅置于藕塊的中央，菌絲體面朝下，每個藕塊均勻接種2 個鐮刀菌菌餅，然后將裝有接種藕塊的發(fā)芽盒放置于24～26℃恒溫培養(yǎng)箱中進行保濕培養(yǎng)；然后按照1.2 的分級標準進行調(diào)查和分級確定。

在篩選蓮抗腐敗病品種研究時，除選用篩選出的強致病性菌株接種菌株外，采用的實生苗蘸根接種，即將破口的蓮籽浸在滅菌水中，24～26℃條件下催芽，每天換水1 次。待蓮籽萌發(fā)長出直立的幼葉、生根3～5 條時，接種蓮腐敗病病原菌。蓮腐敗病病原菌在超凈工作臺上按以下操作進行接種：將每條根在距根尖0.5 cm 處剪斷，以造成根系的微傷口，然后將整個根系浸入由無菌水調(diào)節(jié)的含105～106個孢子/mL 蓮腐敗病病原菌懸浮液中20～40 min。將接種后的實生苗移栽于盆缽中栽培，接種至少20 d后，按照1.2 中所列病害評價等級對葉片進行病害等級鑒定，鑒定后計算病情指數(shù)，確定籽蓮品種對腐敗病的抗病性類型。

對于各種葉部病害的接種，比較了孢子懸浮液接種和菌絲塊接種2 種方法后，采用的是菌絲塊接種：先將待接種的健康幼嫩、無任何斑點和褪綠癥狀的盆栽蓮藕葉片接種部位用無菌水擦拭干凈，然后將分離純化的病菌菌絲塊以針刺法接種于該部位，并用蘸水的無菌脫脂棉保濕，一般24 h 后接種部位就可出現(xiàn)不同的表型。

4.2 病原菌再分離方法的簡化

當應(yīng)用原始菌株接種植物發(fā)病后，對發(fā)病組織進行致病菌再分離時，因接種發(fā)病的病原菌很單一，所以可將發(fā)病的小片組織表面消毒后，在無菌條件下制取植株汁液，稀釋適宜倍數(shù)后進行PDA平板涂布，然后挑取單孢菌落。

5 病原菌保存的方法

PDA 2～3 月即需轉(zhuǎn)管一次。礦物油覆蓋保存，雖然保存的菌種存活期較長，通常2～3 a 才需檢查其存活狀態(tài)，但該種保存效果與操作技術(shù)密切相關(guān)，同時當活化菌種用接種針從礦物油下挑取的菌絲體，因其攜帶有礦物油，所以生長較慢，一般要再移植1～2 次才能得到良好的菌種。 所用的方法是用2 mL 的小離心管，挑取在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢0.5 cm×0.5 cm 的2～3 塊菌絲塊置于其中，加無菌水浸沒菌絲塊并高出菌絲塊0.5 cm，然后將離心管放置于4℃左右的冰箱中，使用時只需在無菌條件下，用接種針挑出置于滅菌的濾紙上吸去多余的水分后置于PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)即可。本實驗室用此方法保存的菌株，6 個月以上仍具有很高的活性。