鄭德義，王毅，杜嬌，李平洋，肖向陽，程代薇，李自力

(貴州省人民醫(yī)院燒傷整形科，貴州貴陽550002)

腸道缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion，II/R)損傷是嚴重創(chuàng)(燒)傷后常見的病理生理過程，腸缺血再灌注不僅引起腸損傷，而且導致機體其他器官如肺、肝及腎臟等多器官損害［1］，發(fā)生多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至多器官衰竭死亡。國內(nèi)文獻多以大鼠、兔等較大型嚙齒動物為實驗對象［2-3］，且腸缺血及再灌注時間不一，本研究以小鼠對實驗對象，探索建立穩(wěn)定的II/R誘發(fā)MODS實驗動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物分組

10周齡健康雄性C57BL/6小鼠72只，體重22～26 g，根據(jù)觀察指標隨機分組。分組1:腸缺血30 min組、40 min組、50 min組和60 min組，每組12只，手術(shù)后7 d時觀察腸缺血不同時間小鼠的生存率。分組2:假手術(shù)組(Sham，6只小鼠)，腸缺血40 min后再灌注組(II/R，18只小鼠)，分別于再灌注1 h、6 h和12 h(各6只)時取標本。實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理學委員會批準。

1.2 方法

參照文獻［4］實驗，所有小鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注入1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，開腹鈍性分離腸系膜前動脈，用動脈夾夾閉腸系膜前動脈(SMA)造成小鼠腸缺血，缺血相應(yīng)時間后松開動脈夾恢復血流再灌注，關(guān)閉腹腔;假手術(shù)組不夾閉SMA(僅開腹后關(guān)閉腹腔)。術(shù)后立即腹壁皮下注入生理鹽水1 mL，自由進飲食。

1.3 檢測指標

觀察分組1中的48只小鼠7 d內(nèi)的生存率，分組2中的24只小鼠分別于相應(yīng)時間，心臟穿刺抽血，室溫靜置、離心(4 000 g/min)15 min分離血清，-80℃保存，統(tǒng)一檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Crea)、乳酸脫氫酶(LDH)水平;腸缺血再灌注后6 h取右上肺葉、肝及腎臟組織做病理學檢查。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 II/R小鼠生存率

觀察腸缺血再灌注后7 d內(nèi)動物生存狀況，隨著腸缺血時間延長，小鼠生存率明顯降低。在觀察期內(nèi)，腸缺血30 min小鼠全部存活，缺血40 min動物生存率60%，缺血50 min小鼠生存率僅50%(在82 h半數(shù)動物死亡)，腸缺血60 min小鼠生存率＜40%(在6 h時半數(shù)動物死亡)。與腸缺血30 min比較，腸缺血50 min和60 min組小鼠死亡率明顯增加(P＜0.05)，見圖1。

圖1 不同腸缺血時間小鼠的生存率Fig.1 Mice survival rate in differentischemia time groups

2.2 血清ALT、AST、Crea和LDH

小鼠腸缺血再灌注1 h時，僅有Crea指標高于假手術(shù)組(P＜0.01)，腸缺血后再灌注6 h，4項血清學指標均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);而在12 h血清指標中僅有ALT及AST明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。結(jié)果提示，小鼠腸缺血再灌注損傷所引起的MODS在手術(shù)后6 h是最為顯著，是最佳時間點。見表1。

2.3 肺、肝和腎組織改變

假手術(shù)組小鼠肺、肝臟及腎臟組織形態(tài)正常。II/R后6 h肺、肝臟及腎臟發(fā)生病理改變，主要肺組織充血，肺間質(zhì)炎性細胞浸潤;肝細胞水樣變性、氣球樣變性，部分有炎性細胞浸潤;腎小管上皮細胞水腫(圖2)。

表1 腸缺血后不同再灌注時間血清生化指標變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

表1 腸缺血后不同再灌注時間血清生化指標變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

(1)與sham比較，P＜0.01

再灌注時間1 h 6 h 12 h ALT(u/L)40.25±2.63 56±20.07 179.5±141.59(1)128.33±89.67(1)生化指標sham 1910.33±369.85 AST(u/L)195.75±57.53 156.67±22.37 483.33±176.31(1)365±117.29(1)Crea(mmol/L)5.25±0.96 17.67±12.58(1)10.33±1.86(1)8.00±2.65 LDH(u/L)1496.75±382.85 1406.33±1136.55 3119±947.58(1)

圖2 各組小鼠肺、肝和腎組織學表現(xiàn)(HE，×100)Fig.2 The pathological change of lung，liver and kidney induced by II/R

3 討論

腸缺血再灌注是嚴重創(chuàng)傷、燒傷體克后救治過程中可能發(fā)生的一個共同的病理生理階段。腸缺血再灌注損傷后腸黏膜屏障受損及功能下降、促使腸道細菌及內(nèi)毒素移位，氧自由基損害、中性粒細胞活化和各種炎性細胞因子的過度合成及釋放，誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，導致肺、肝、腎臟等遠隔臟器的損害［1］，是ARDS和MODS發(fā)生的重要原因［5-6］。研究II/R損傷的發(fā)病機制，首先建立穩(wěn)定、可靠的實驗動物模型是關(guān)鍵。

本實驗表明，隨著腸缺血時間增加，動物存活率逐漸降低，腸缺血60 min組小鼠，再灌注6 h時半數(shù)動物死亡，顯然不適合作為研究模型。腸缺血時間40～50 min小鼠在1周觀察期內(nèi)，半數(shù)以上存活，是較為理想的腸缺血時間。因此，選擇腸缺血40 min后再灌注1 h、6 h及12 h時，觀察肝、腎及全身組織器官功能損傷情況及血清AST、ALT、LDH及Crea水平。LDH幾乎存在于所有器官組織細胞內(nèi)，是有機體能量代謝過程中參與糖酵解的重要酶，當組織器官發(fā)生病變時，細胞膜通透性增加，釋放更多的LDH到細胞間隙和體液，LDH水平是反應(yīng)細胞膜損傷較靈敏的指標之一，是目前比較公認測定細胞膜損傷的指標［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸缺血再灌注1 h時血清學指標僅有Crea高于假手術(shù)組，提示此時再灌注造成的損傷并不明顯;12 h時血清學指標僅有ALT和AST高于假手術(shù)組，提示再灌注12 h時組織器官的修復功能可能部分恢復;再灌注6 h時血清學4項指標明顯高于假手術(shù)組，而且病理檢查提示，腸缺血后再灌注6 h，肺、肝臟及腎臟發(fā)生改變，主要表現(xiàn)組織細胞水腫、變性，伴隨炎癥細胞浸潤，提示小鼠缺血再灌注6 h是觀察MODS模型的最佳時間點。模型制作過程中，因小鼠體形小，要求手術(shù)操作熟練、輕柔、精細，減少腹腔臟器的翻動，術(shù)中、術(shù)后注意保溫，缺血期間斷縫合或蚊式鉗夾閉暫時關(guān)閉腹腔，以防腸組織及腹腔體液外滲。

綜上所述，應(yīng)用阻斷小鼠腸系膜上動脈40～50 mim再灌注6 h，既能保證動物生存率，滿足實驗要求，又能形成腸道及遠隔器官損傷及功能障礙，為進一步研究腸缺血再灌注誘發(fā)MODS發(fā)病機制的提供依據(jù)。

［1］Harward TR，Brooks DL，F(xiàn)lynn TC，et al.Multiple organ dysfunction after mesenteric artery revascularization［J］.J Vasc Surg，1993(18):459-469.

［2］朱枝祥，陳丁丁.腸系膜動脈缺血再灌注誘發(fā)多器官功能障礙綜合征模型研究［J］.抗感染藥學，2010(2):93-96.

［3］宋富波，楊牟，車海杰.兔急性腸道缺血再灌注損傷模型的建立［J］.青島大學醫(yī)學院學報，2010(2):166-170.

［4］鄭德義，王建明，賈一韜，等.p38絲裂原活化蛋白激酶在小鼠腸缺血再灌注肺損傷中的作用［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2010(3):254-257.

［5］Takayama M，Ishibashi M，Ishii H，et al.Effects of neutrophil elastase inhibitor(ONO-5046)on lung injury after intestinal ischemia-reperfusion［J］.JAppl Physiol，2001(4):1800-1807

［6］Yao Y，Yu Y，Wu Y，et al.The role of gut as a cytokine-generating organ in remote organ dysfunction after intestinal ischemia and reperfusion［J］.Chin med J，1998(6):514-518.

［7］王敏，俞詩源，劉佳昕，等.X射線輻射對小鼠腎組織中乳酸脫氫酶、Na+-K+ATP酶活性及caspase-3蛋白、Bax蛋白表達的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2014(2):41-47.