何旭峰 肖昌松 肖俊霞

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后嘌呤P2Y4受體表達變化的實驗探究

何旭峰 肖昌松 肖俊霞

目的 探討大鼠坐骨神經(jīng)受損是否會影響嘌呤P2Y4受體表現(xiàn)，對三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷(ATP/UTP)對周圍受損神經(jīng)起到的積極作用進行研究。方法 取36只SD大鼠作為研究對象，將36只大鼠隨機均分為正常組、對照組以及觀察組。對觀察組大鼠行一側(cè)坐骨神經(jīng)切斷修復(fù)模型，分別在術(shù)后1d、1、2、3、4周后處死大鼠，取出部分坐骨神經(jīng)，脊髓以及神經(jīng)節(jié)。對照組大鼠僅做切口，不進行其他手術(shù)；正常組為正常參照對象，同時檢測RT-PCR（半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）產(chǎn)物的序列。結(jié)果 正常組大鼠與對照組大鼠脊髓與坐骨神經(jīng)均發(fā)現(xiàn)P2Y4mRNA表達［正常組脊髓：（0.215±0.032），坐骨神經(jīng)：（0.643±0.011）；對照組脊髓：（0.221±0.027），坐骨神經(jīng)：（0.653±0.012）］；2組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。觀察組大鼠坐骨神經(jīng)切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現(xiàn)象。結(jié)論 觀察組大鼠坐骨神經(jīng)切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現(xiàn)象，近端呈逐漸減弱現(xiàn)象。

坐骨神經(jīng)；P2Y4mRNA；背根神經(jīng)節(jié)

細胞外三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷(ATP/UTP)的主要作用為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)。據(jù)了解，ATP/UTP經(jīng)受體能直接作用于神經(jīng)系統(tǒng)，有助于促進膠質(zhì)細胞、軸突組織修復(fù)或再生，因此臨床多被用來治療腦外傷或腦缺血性損傷[1]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，坐骨神經(jīng)受損后，細胞外ATP參與促進軸突再生，神經(jīng)修復(fù)等活動。不過現(xiàn)階段，該作用機制暫時尚不明確[2]。為了進一步研究該作用的機制，進行了此研究，取得了較明確的研究結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 取36只SD清潔級雄性大鼠[SCXK (浙)2012-0033]作為研究對象，36只SD大鼠鼠齡2～3個月，體質(zhì)量120～180g。將36只大鼠隨機均分為正常組、對照組與觀察組[3]，每組12只。

1．1．2 試劑與儀器

1．2 方法

1．2．1 動物模型制作 正常組大鼠為正常參照組，對照組大鼠僅做切口不進行其他手術(shù)。使用1%異戊巴比妥鈉對觀察組大鼠進行腹腔麻醉，切開大鼠左側(cè)臂肌，充分暴露手術(shù)視野，于梨狀肌下端尋找到坐骨神經(jīng)，切斷后利用無創(chuàng)縫線縫合切口處外膜，利用縫線于手術(shù)切口兩側(cè)做標(biāo)記[4]。對觀察組大鼠行一側(cè)坐骨神經(jīng)切斷修復(fù)模型，分別于術(shù)后1d、1、2、3、4周后處死大鼠，取出部分坐骨神經(jīng)，脊髓以及神經(jīng)節(jié)。

1．2．2 標(biāo)本收集 所有大鼠均采用1%異戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，切開大鼠左側(cè)臂肌，充分暴露手術(shù)視野，于梨狀肌下端尋找到坐骨神經(jīng)，切斷取出留以備用。并于大鼠背側(cè)行縱切口，借助顯微鏡，采集部分脊髓與左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)。取出后剝離外膜，反復(fù)沖洗取出物，與坐骨神經(jīng)標(biāo)本一起封存于液氮中，方便實驗取用。

1．2．3 RT-PCR（半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） 取備用組織 3mg，研碎后提取 RNA。利用紫外分光光度計測量RNA的濃度，加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶充分反應(yīng)，合成cDNA的第一鏈。根據(jù)參考文獻配置PCR引物，上游5c-T GGGTGTTTGGT TGGTAGTA-3，下游5c-GT CCCCCGTGAAGAGAT AG- 3c。將BActin設(shè)置為內(nèi)參對照：上游5c-CCT TCCT GGGCAT GGAGTCCTG-3c，下游5c-GGAGCAATGATCTT GATCTT C-3c[5]。為確保內(nèi)參數(shù)與目的基因存在可比性，可對PCR行擴增處理，使反應(yīng)進入到平臺期以前，于指數(shù)增長期就結(jié)束。

1．2．4 檢測操作 使用瓊脂糖凝膠電泳測量PCR水平，利用UVPgrab-it做成像處理，呈像結(jié)果經(jīng)Gelworks ID Advanced V4 01 圖像分析軟件進行處理。取100μL物電泳后純化，于ABI PRISM 自動測序儀內(nèi)，檢測序列。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有的數(shù)據(jù)都經(jīng)過SPSS14．0/PC+軟件包加工處理，計量資料采用“x±s”表示，使用t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 正常組與對照組大鼠檢測結(jié)果 檢測結(jié)果顯示，2組大鼠脊背與坐骨神經(jīng)均檢測到在P2Y4嘌呤受體，且顯示有規(guī)律性，2組大鼠脊神經(jīng)節(jié)均不存在有規(guī)律片段［正常組脊髓：（0．215±0．032），坐骨神經(jīng)：（0．643±0．011）；對照組脊髓：（0．221±0．027），坐骨神經(jīng)：（0．653±0．012）］，2組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2．2 P2Y4mRNA 表達的規(guī)律 PCR經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄處理后，取出464bp的片段；B-Actin獲得205bp片段。這些片段均能在正常組大鼠的脊髓（0．217±0．023）、神經(jīng)近端（0．655±0．022）與遠端（0．656±0．011）中檢測到。觀察組大鼠坐骨神經(jīng)切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現(xiàn)象［脊髓：1周（0．431±0．022），2周（0．521±0．014）；神經(jīng)近端：1周（0．499±0．014），2周（0．382±0．047）；神經(jīng)近端1周（0．825±0．054），2周（0．918±0．015）］。

3 討論

Aonok等在1990年發(fā)現(xiàn)ATP等和其代謝產(chǎn)物，可通過受體提高細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度對PC12細胞發(fā)揮保護作用[6]，嘌呤能受體由Burnstock于1978年被正式命名[6]，根據(jù)組織反應(yīng)類型與催化劑功能強度，發(fā)現(xiàn)P2嘌呤受體可被歸為P2X和P2Y2大類型。P1型受體主要介導(dǎo)nine和AMP的作用，P2受體主要介導(dǎo)P2X和P2Y2大類型。P2X受體主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌細胞、支氣管上皮等，P2Y受體主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細胞等部位，用于參與細胞增殖與分化活動。坐骨神經(jīng)中，主要存在P2Y2、P2Y4和P2Y6這三大類P2Y亞型受體。通過多年研究經(jīng)驗不難發(fā)現(xiàn)，鼠類P2Y4受體和人類的P2Y4受體基因序列吻合度高達84%，且絕大多數(shù)序列都處于跨膜去與胞外環(huán)，具有參考價值。P2Y4受體主要分布于大鼠腦組織與脊髓內(nèi)，能促進中樞受損細胞再生與修復(fù)。P2Y4受體在肝內(nèi)膽管、膽囊上皮及空腸上皮，促進氯離子的分泌。本研究結(jié)果顯示，P2Y4受體可在脊髓灰之中表達，表達主要集中在前交運動神經(jīng)元與中央管上皮細胞，且于白質(zhì)中呈陰性，且脊髓、背根神經(jīng)節(jié)及坐骨神經(jīng)有恒定表達[7]，這一實驗結(jié)果與本研究預(yù)測實驗記過基本相符。經(jīng)序列測定，結(jié)果顯示與現(xiàn)有文獻研究結(jié)論完全吻合[8]。該實驗結(jié)果提示，正常SD大鼠脊髓與坐骨神經(jīng)中，均能檢測到受體表達，而脊神經(jīng)節(jié)中未發(fā)現(xiàn)受體表達。由此推斷，僅做切口不行手術(shù)，不會影響P2Y4mRNA的表達。脊髓內(nèi)表達在2周內(nèi)達到最活躍狀態(tài)，4周后逐步接近正常值[9]。這主要是由于骨神經(jīng)損傷的保護性作用，參與了維持脊椎神經(jīng)元的存活，從而有利于周圍神經(jīng)的再生。

RT-PRC是一種靈活度很高的實驗技術(shù)，為了達到保證內(nèi)參和目的基因的可比性，實驗對PRC進行擴增。經(jīng)過長時間的觀察，推測ATP/UTP通過P2Y4受體參與了周圍神經(jīng)損傷后的病例調(diào)理與改變，在神經(jīng)修復(fù)中起重要作用。

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10．3969/j．issn．1009-4393．2015．18．008

湖南 421002 衡陽核工業(yè)衛(wèi)生學(xué)校 （何旭峰 肖昌松 肖俊霞）