徐瑤 朱瑩瑩 李軍鴿 李佳美 朱凱 王書凱

【摘 要】 目的：取十個不同產(chǎn)地的人參藥材，分別進行雙向固體發(fā)酵，比較發(fā)酵前后主要皂苷成分變化。方法：用高效液相色譜法測定發(fā)酵前后人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3的含量，找出發(fā)酵前后所測皂苷的變化情況。結(jié)果：十產(chǎn)地人參藥材主要皂苷含量雖有差異，但發(fā)酵后成分變化規(guī)律相同。在雙向固體發(fā)酵30天后，Rg1、Re、Rb1含量均大幅度下降，Rh1、Rd、Rg3含量均有明顯升高。結(jié)論：雙向固體發(fā)酵可將普通人參皂苷轉(zhuǎn)化為Rd及稀有皂苷Rh1和Rg3。

【關(guān)鍵詞】 人參皂苷 ?雙向固體發(fā)酵 ?成分變化

人參（Panax ginseng C.A.Mey）是五加科植物，一般指的人參藥材為其干燥根和根莖。人參的主要有效成分為人參皂苷，根據(jù)苷元的不同分為三類[1]：齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷、人參二醇類四環(huán)三萜皂苷、人參三醇類四環(huán)三萜皂苷。人參皂苷Re、Rb1等在人參中含量很高，而有些人參皂苷在人工栽培的人參中極微量或根本不存在，如人參皂苷Rh1、Rg3、CK等，被稱為稀有皂苷，卻擁有更好的活性，在抗腫瘤、抗衰老、抗炎和保肝等[2]方面表現(xiàn)出了極大的潛力。本實驗對十產(chǎn)地人參通過前期選育得到的靈芝菌進行雙向固體發(fā)酵，比較發(fā)酵前后人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3的含量變化，為利用該生物轉(zhuǎn)化手段將主要人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷提供有力的佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

來源為靖宇縣、撫松縣露水河鎮(zhèn)、撫松縣松江河鎮(zhèn)、撫松縣、長白山、撫松縣泉陽鎮(zhèn)、撫松縣東崗鎮(zhèn)、撫松縣漫江鎮(zhèn)、撫松縣興參鎮(zhèn)和撫松縣萬良鎮(zhèn)已按2010版《中國藥典》方法檢測達標的吉林省十產(chǎn)地人參藥材。

1.2 試劑和儀器

色譜純甲醇、乙腈購自Fisher Scientific;分析純甲醇、磷酸購自北京化工廠;水為杭州娃哈哈集團有限公司產(chǎn)娃哈哈飲用純凈水;人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3對照品購自中國藥品生物制品鑒定所;AB-135S十萬分之一天平;KQ-250B型超聲波清洗器;SORVALL Evolution RC高速離心機;Agilent 1260高效液相色譜儀;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋;恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐若儀表有限公司）;BIC-250型人工氣候箱;DHG7-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3 人參雙向固體發(fā)酵

十產(chǎn)地人參分別粉碎，過1號篩，加入適量的水和生長因子，混勻制成固體培養(yǎng)基，平均分裝于三角瓶中，121℃滅菌60min，放入接種室冷卻至室溫。將已經(jīng)培養(yǎng)好的靈芝種子液以一定的比例接入瓶裝固體培養(yǎng)基中，放入人工氣候箱中28℃避光培養(yǎng)30天。待菌絲已長滿瓶底，取出，放入55℃烘箱，干燥后即為人參藥性菌質(zhì)。

1.4 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3、Rh1含量測定

1.4.1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3含量測定色譜條件

色譜柱Agilent-SB（4.6×250mm，5μm），流動相：乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫（見表1），柱溫：30℃，流速：1ml/min，檢測波長：203nm。

1.4.2 人參皂苷Rh1含量測定的色譜條件

色譜柱GL Sciences-ODS（4.6×250mm，5μm），流動相：乙腈-水（26.5：73.5），柱溫：30℃，流速：1ml/min，檢測波長：203nm。

1.4.3 對照品溶液的制備

將6種人參皂苷對照品分別以甲醇為溶劑精密配置成0.2mg/ml的溶液。

1.4.4 供試品溶液的制備

取十產(chǎn)地人參及發(fā)酵后藥材粉碎，過4號篩，分別精密稱定1.25g，置于錐形瓶中，并精密加入25ml甲醇，密塞稱重后，超聲處理30min，超聲后冷卻補重，離心（8000r/min，20min），取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得[3]。

1.4.5 含量測定

精密吸取上述制備液各20μl，用高效液相色譜儀進行分析， 每個供試品平行進2針，通過計算得出6種人參皂苷的含量，并對十產(chǎn)地人參雙向固體發(fā)酵前后以上成分含量變化進行比較。

2 結(jié)果

2.1 十產(chǎn)地人參藥材6種皂苷含量比較

實驗中可知十產(chǎn)地人參藥材中，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd含量差異較大。其中，Rh1含量極微，人參皂苷Rg3幾乎檢測不到。結(jié)果分析表明，從靖宇縣人參藥材含二醇類和三醇類四環(huán)三萜皂苷量最高，三醇類皂苷（以Rg1、Re作參考）含量可達到其它產(chǎn)地的1.6～2.6倍，二醇類皂苷（以Rb1作參考）含量可達到其它產(chǎn)地的1.6～5.9倍，可見，不同產(chǎn)地人參藥材各成分差異之大。

2.2 十產(chǎn)地人參發(fā)酵前后6種皂苷含量變化規(guī)律

發(fā)酵前后皂苷含量變化各不相同，但呈現(xiàn)出相同的轉(zhuǎn)化規(guī)律：Rg1、Re、Rb1含量均大幅度下降，Rd、Rg3、Rh1含量均有明顯升高（可參考圖1～圖2）。

3 討論

十產(chǎn)地人參雖都產(chǎn)自吉林，但測定結(jié)果表明，不同皂苷含量差異甚大。比較十產(chǎn)地人參發(fā)酵前后6種皂苷的含量變化發(fā)現(xiàn)，Rg1、Re、Rb1含量下降明顯，Rh1、Rd、Rg3含量明顯升高，可以推測原人參藥材中的主要皂苷Rg1、Re、Rb1通過雙向固體發(fā)酵的手段發(fā)生了轉(zhuǎn)化。而Rh1、Rd、Rg3含量的增加是與Rg1、Re、Rb1含量的減少有直接或間接關(guān)系的，Rg1可直接轉(zhuǎn)化為Rh1（Rg1C20葡萄糖苷鍵斷裂）[4]，Re可通過Rg1直接或間接轉(zhuǎn)化為Rh1（ReC6末端的鼠李糖糖苷鍵斷裂轉(zhuǎn)化為Rg1，Rg1C20上葡萄糖苷鍵斷裂轉(zhuǎn)化為Rh1）[5，6]，Rb1可通過Rd直接或間接轉(zhuǎn)化為Rg3（直接水解或相繼水解Rb1C20上的兩個葡萄糖）[7]。稀有皂苷明顯增加，給靈芝菌種對人參藥材的雙向固體發(fā)酵研究帶來了更大的研究意義，稀有人參皂苷Rh1和Rg3均為抗癌活性較強的成分。而對于轉(zhuǎn)化的機理，需要進一步研究。

參考文獻

[1]楊金玲，高麗麗，朱平.人參皂苷生物合成研究進展[J].藥學學報，2013，48（2）：170-178.

[2]Jong-Jin Lee， Ho-Kyun Kwon， In-Ho Jung，et al.Anti-cancer Activities of Ginseng Extract Fermented with Phellinus linteus[J].Mycobiology，2009，37（1）：21-27.

[3]游元元.人參總皂苷的指紋圖譜分析[J].西南軍醫(yī)，2006，8（6）：37-38.

[4]張怡軒，陳曉瑩，趙文倩.人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2008，25（5）：419-422.

[5]弓曉杰.人參皂苷酶代謝產(chǎn)物化學修飾及其抗癌活性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2004.

[6]呂永俊，徐綏緒.人參皂苷的化學研究方法[J].沈陽藥學院學報，1985，2（1）：63-82.

[7]Le-Qin Cheng，Ju Ryun Na，Myun Ho Bang，et al.Conversion of major ginsenoside Rb1 to 20（S）-ginsenoside Rg3 by Microbacterium sp.GS514[J].Phytochemistry，2008，69：218-224.