鄒淑君，張 蕾，郭迎喜，徐 暘，許樹(shù)軍*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.藥學(xué)院；b.實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江 哈爾濱150040）

橙皮素（Hesperetin），化學(xué)名5,7,3′- 三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮，為柑橘果實(shí)中主要活性成分橙皮苷的水解產(chǎn)物。在國(guó)外，橙皮素用做心血管保健藥物，也做為抗氧化劑用于化妝品和食品添加劑中[1]。橙皮素分子具有4- 羰基、5- 羥基結(jié)構(gòu)，易與過(guò)渡金屬離子配位形成配合物。過(guò)渡金屬銅在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，Cu2+也是容易發(fā)生配位反應(yīng)的重要金屬離子。本研究參考文獻(xiàn)[2]，用橙皮素與Cu2+反應(yīng)合成橙皮素銅配合物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Hes-Cu），其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。測(cè)試了Hes-Cu 與牛血清白蛋白（BSA）之間的作用，并同橙皮素與BSA 之間的作用進(jìn)行比較。以考察Cu2+的引入對(duì)橙皮素與血清蛋白作用的影響，以間接探索橙皮素被吸收入血液后，在血液中儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)及與靶向物質(zhì)作用的過(guò)程中受Cu2+影響的情況。

圖1 橙皮素銅配合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of hesperetin copper（II）complex

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮素（Hes 98%）（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（簡(jiǎn)稱(chēng)Tris 99.8%）（上海博宏生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA 99.8%）（美國(guó)Sigma 公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水；其它常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PB-20 型pH 計(jì)（德國(guó)賽多利斯）；SK250LH 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)）；XS105DU 型電子分析天平（瑞士梅特勒）；CU600 型溫水浴鍋（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；RF-5301PC 熒光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用 移 液 槍 分 別 取0，200，400，600，800，1000，1200，1400，1600，1800，2000μL 的橙皮素銅配合物溶液（1.0×10-4mol·L-1，用少量DMSO 超聲溶解后，再用二次蒸餾水定容），加入到盛有1.00mLBSA（1.0×10-5mol·L-1）溶液的10mL 容量瓶中，用Tris-HCl（pH=7.40）溶液定容混勻。3 次操作，分別置于290、300、310K 水浴中溫育15min，取出后用熒光光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，固定激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，在300～550nm范圍內(nèi)掃描樣品溶液的熒光光譜。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均參照文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮素銅配合物與牛血清白蛋白作用的熒光光譜

圖2 給出了300K 時(shí)，不同濃度的Hes-Cu 存在下的BSA 的發(fā)射光譜。

由2 圖可見(jiàn)，隨著Hes-Cu 濃度的增加，BSA 的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸減小，且減小的幅度越來(lái)越小。這表明實(shí)驗(yàn)所測(cè)的Hes-Cu 濃度都可以使BSA 的內(nèi)部熒光發(fā)生猝滅，Hes-Cu 與BSA 之間都存在相互作用。且隨Hes-Cu 濃度的增加，二者的結(jié)合趨向飽和。Hes-Cu 不但猝滅BSA 內(nèi)源熒光的強(qiáng)度，而且引起B(yǎng)SA 內(nèi)源熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生明顯的紅移。紅移幅度均約2～9nm；配合物濃度越大，紅移程度越大。表明Hes-Cu 與BSA 結(jié)合后使BSA 的色氨酸或酪氨酸周?chē)h(huán)境的親水性增加。對(duì)比文獻(xiàn)[3]可以判斷，Hes-Cu 使BSA 內(nèi)源熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移幅度比橙皮素大，說(shuō)明受金屬Cu2+的影響，使配合物對(duì)BSA 的氨基酸周?chē)h(huán)境的極性改變程度增大。

圖2 橙皮素銅配合物對(duì)BSA 的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of BSA upon addition of hesperetin copper（II）complex[BSA]=1.0×10-6mol·L-1,a～k：[ Hes-Cu]/[BSA]= 0, 2.0, 4.0, 6.0,8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 18.0, 20.0

由圖2 還可見(jiàn)，Hes-Cu 對(duì)BSA 的影響體系中，在410nm 左右出現(xiàn)了一個(gè)熒光發(fā)射峰，且發(fā)射峰的強(qiáng)度隨著Hes-Cu 濃度的增加而增強(qiáng)。這可能是溶液中游離的配合物產(chǎn)生的[4]。

參照文獻(xiàn)[3]的方法，計(jì)算得到在實(shí)驗(yàn)條件下，Hes-Cu 在2×10-6～1×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)BSA 的熒光猝滅率，與橙皮素對(duì)比的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 橙皮素銅配合物及橙皮素對(duì)BSA 的熒光猝滅率Fig.3 Fluorescence quenching efficiency of BSA upon additionof hesperetin copper（II）complex and hesperetin

相同濃度時(shí)，從整體規(guī)律看，配合物對(duì)BSA 熒光猝滅程度率比相橙皮素對(duì)BSA 熒光猝滅率小。

2.2 橙皮素銅配合物對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅機(jī)理

圖4 為Hes-Cu 分別在3 個(gè)不同溫度下（290、300 和310K）與BSA 相互作用的Stern-Volmer 曲線。根據(jù)Stern-Volmer 方程F0/F=1＋Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]求得配合物的猝滅常數(shù)Ksv及Kq并列于表1中，方程式中各符號(hào)的意義參看文獻(xiàn)[3]。

圖4 橙皮素銅配合與BSA 作用的Stern-Volmer 曲線Fig.4 Stern-Volmer plots of BSA fluorescence quenching caused by the addition of hesperetin copper（II）complex

結(jié)合圖4 和表1 可以看出，在290、300、310K下Hes-Cu 與BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq 均大于猝滅劑與生物聚合物大分子相互作用的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)（2.0×1010L·mol-1·s-1），初步認(rèn)為猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅。且靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv（290K）＞Ksv（300K）＞Ksv（310K），即隨著溫度升高，Ksv減小，進(jìn)一步表明Hes-Cu 對(duì)BSA 熒光的猝滅可能是由分子間形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

可見(jiàn)，橙皮素銅配合物較規(guī)律的符合溫度升高，靜態(tài)猝滅常數(shù)降低，所以橙皮素銅配合物對(duì)BSA的熒光猝滅應(yīng)以靜態(tài)猝滅為主，即配合物都與BSA結(jié)合形成了復(fù)合物。對(duì)比文獻(xiàn)[3]中橙皮素與BSA 作用的結(jié)果，配合物結(jié)合BSA 的靜態(tài)猝滅速率常數(shù)小于橙皮素結(jié)合BSA 的靜態(tài)猝滅速率常數(shù),降低1 個(gè)數(shù)量級(jí)，可見(jiàn)，配合物與BSA 的靜態(tài)結(jié)合率減弱。

2.3 用靜態(tài)猝滅法分析橙皮素銅與牛血清白蛋白作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

參照文獻(xiàn)[3]計(jì)算橙皮素銅配合物與BSA 作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下橙皮素銅配合物與BSA 作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab.1 Quenching constants, binding constants and the number of binding sites of the systems of Hes-Cu-BSA at differenttemperatures

由表1 可見(jiàn)，橙皮素銅配合物與BSA 作用的結(jié)合常數(shù)Ka值多為103～104量級(jí)，說(shuō)明橙皮素銅配合物與BSA 之間有一定的結(jié)合作用。Ka隨著溫度的增加呈現(xiàn)不規(guī)律性變化；結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均比1 小很多。對(duì)比文獻(xiàn)[3]中橙皮素的相關(guān)參數(shù)可見(jiàn)，橙皮素銅配合物與BSA 之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)平均值遠(yuǎn)小于橙皮素與BSA 之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)?？梢?jiàn)配合物的形成，Cu2+占據(jù)了橙皮素與BSA 之間作用的有效基團(tuán)，從而減弱了配合物與BSA 之間的靜態(tài)復(fù)合作用，這與有些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相似[5]。另一方面也可能是金屬離子配位空間的四面體或八面體構(gòu)型，使配合物空間立體結(jié)構(gòu)與BSA 的折疊結(jié)構(gòu)所能提供的合適取向不匹配而導(dǎo)致形成復(fù)合物的能力降低。

2.4 橙皮素銅配合物與牛血清白蛋白之間作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類(lèi)型

參照文獻(xiàn)[3]計(jì)算在290～310K 范圍內(nèi)橙皮素銅配合物與BSA 的結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)，配合物與BSA 的作用過(guò)程為ΔG=-25.01kJ·mol-1，表明是自發(fā)過(guò)程。橙皮素銅與BSA 的作用過(guò)程的ΔH=-71.96kJ·mol-1，ΔS=-161.93kJ·mol-1，表明范德華力及氫鍵是配合物與BSA 的主要作用力。對(duì)比橙皮素來(lái)說(shuō)，橙皮素銅配合物的作用力類(lèi)型雖未改變，但熱力學(xué)參數(shù)變化很大。

3 結(jié)論

本部分工作是應(yīng)用熒光光譜法分析了橙皮素銅配合物與BSA 的相互作用關(guān)系，探討了因形成銅配合物對(duì)橙皮素與BSA 作用的影響?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論。

（1）配合物均能有效猝滅BSA 的熒光，猝滅機(jī)理與橙皮素相似，是與BSA 結(jié)合形成復(fù)合物導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅為主。但銅配合物對(duì)BSA 的熒光猝滅率小于橙皮素；

（2）對(duì)比橙皮素，銅配合物對(duì)BSA 的結(jié)合常數(shù)變小，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)也明顯減小。

（3）配合物與BSA 作用力類(lèi)型與橙皮素相似，也以范德華力為主。預(yù)測(cè)造成以上不同的可能原因是：金屬離子的引入，使橙皮素與BSA 作用的有效位點(diǎn)被金屬離子占據(jù)，據(jù)此估計(jì)橙皮素4 位羰基與5 位羥基可能是與BSA 作用的有效位點(diǎn)。

因此，在考慮橙皮素進(jìn)入生物體血液中，從貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放、至作用于靶點(diǎn)的整個(gè)過(guò)程，Cu2+都可能是重要的影響因素，因?yàn)樵谏韕H 條件下，它可與橙皮素發(fā)生配位作用而減弱橙皮素與蛋白的結(jié)合作用。

［1] 劉學(xué)仁,張瑩.橙皮苷和橙皮素生物活性的研究進(jìn)展［J].中國(guó)新藥雜志,2011,20（4）:329-333.

［2] 朱金嬋.三種黃酮銅配合物的合成及其生物活性研究［D].中國(guó)優(yōu)秀碩博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù):廣西師范大學(xué),2008.

［3] 鄒淑君,張蕾,郭迎喜,等.橙皮素及橙皮苷與牛血清白蛋白作用的比較［J].中醫(yī)藥信息,2014,31（2）:8-12.

［4] 劉哲,王坤杰,宋玉民,等.水楊酸金屬配合物與牛血清白蛋白的相互作用［J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2010,26（1）:72-78.

［5] 蔣新宇,李文秀,陳景文.鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清蛋白的結(jié)合［J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2008,24（10）:1588-1595.