楊正時，房 海

(1 中國食品藥品檢定研究院，北京，100050；2 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室；3 河北科技師范學(xué)院)

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巴斯德開啟預(yù)防醫(yī)學(xué)的大門
——紀(jì)念路易斯·巴斯德發(fā)明狂犬病疫苗130周年

楊正時1,2，房 海2,3

(1 中國食品藥品檢定研究院，北京，100050；2 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室；3 河北科技師范學(xué)院)

路易斯·巴斯德(Louis Pasteur,1822-12-27～1895-09-28)是法國偉大的科學(xué)家，他發(fā)明了狂犬病疫苗，并于1885年7月6日，首次給被狂犬嚴(yán)重咬傷的9歲男童約瑟夫·邁斯特(Joseph Meister，1876-02-21～1940-06-24)治療并獲得成功。從此，人們普遍將巴斯德使用狂犬病疫苗首次對人進行接種的這一日期(7月6日)，作為了人類歷史上用人工制備疫苗來征服傳染病的時代起點。到2015年7月6日，歷史的車輪已經(jīng)走過了漫長的130年?？v觀巴斯德的科學(xué)生涯，可以大致劃分為3個階段：①1856年前的化學(xué)年代；②以1856年研究發(fā)酵開始接觸到了微生物為起點，進入生命科學(xué)年代；③以1865年研究蠶病為起步標(biāo)志，進入醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī)學(xué))年代。巴斯德在化學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)乃至農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都有獨到的發(fā)現(xiàn)與研究，然而使他留芳千古的是病原學(xué)說的創(chuàng)立和免疫預(yù)防接種的發(fā)明。在發(fā)明疫苗的探索中，巴斯德找到了開啟疫苗大門的鑰匙——控制病原體的毒力。他發(fā)現(xiàn)了使雞霍亂病原細(xì)菌——多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)自然減毒的途徑，更可貴的是使炭疽芽孢桿菌發(fā)生人為的毒力變異，并成功發(fā)明了雞霍亂疫苗、炭疽減毒疫苗。在對狂犬病疫苗研究中通過采用兔腦傳代的方法，建立了由街毒向固定毒演變的狂犬病病毒固定毒經(jīng)典理論，并成功研制出了安全有效的狂犬病疫苗，同時建立了對狂犬病的巴斯德預(yù)防治療法?？袢∫呙绨倌陙黼m不斷地推陳出新，但巴斯德創(chuàng)造的原理仍為經(jīng)典的指導(dǎo)原則。

路易斯·巴斯德；狂犬病疫苗；預(yù)防獸醫(yī)學(xué)

狂犬病是人類有史以來病死率最高，也還未能找到有效治療方法的傳染病。同時，狂犬病又是完全能預(yù)防，也最能體現(xiàn)“預(yù)防為主”精神的疾病。狂犬病疫苗是特效預(yù)防狂犬病的唯一生物制劑，其發(fā)明人是法國科學(xué)家路易斯·巴斯德(Louis Pasteur,1822-12-27～1895-09-28)。2015年7月6日，是巴斯德發(fā)明狂犬病疫苗發(fā)明130周年[1，2]。

巴斯德(圖1，源自：http://image.baidu.com)，1822年12月27日出生于法國東部汝拉省的多爾城。1843～1848年，在巴黎高等師范學(xué)院學(xué)習(xí)化學(xué)，1847年獲化學(xué)科學(xué)博士學(xué)位，1848年在酒石酸鹽的晶體研究中發(fā)現(xiàn)同分異構(gòu)體而獲得了英國皇家學(xué)會頒發(fā)的朗福德獎?wù)?Rumford medal)。1849～1854年，在斯特拉斯堡大學(xué)教授化學(xué)。1854～1857年，任里爾大學(xué)理科系主任，開始研究甜美的發(fā)酵，提出細(xì)菌發(fā)酵理論。1862年當(dāng)選為法國科學(xué)院院士。1864年，開設(shè)自然生發(fā)講座，發(fā)明了挽救釀酒工業(yè)的巴斯德殺菌法。1865年，研究蠶病，發(fā)現(xiàn)蠶軟腐病和蠶孢子蟲病的起因與采用隔離消毒的預(yù)防措施，挽救了法國，歐洲的絲綢工業(yè)，1870年出版《蠶病學(xué)》。1871年，開始研究啤酒發(fā)酵。1877年開始研究炭疽熱，并與1881年在普宜公開展示炭疽疫苗預(yù)防接種效果。1880年研制出雞霍亂疫苗，并開始研究狂犬病。1885年7月6日，首次對被狂犬嚴(yán)重咬傷的9歲男童約瑟夫·邁斯特(Joseph Meister，1876-02-21～1940-06-24；圖2，源自：http://en.wikipedia.org)，進行了狂犬病疫苗接種并獲得成功，也因此轟動了世界，成為開啟現(xiàn)代疫苗時代的標(biāo)志性起始點。1888年創(chuàng)立了世界上最有名望的生物研究中心之一的巴斯德研究所(圖3)，并任研究所第一任所長直至1895年。1895年9月28日，這位為征服細(xì)菌，造福人類而奮斗終生的科學(xué)家溘然長逝于巴黎近郊的圣克勞德，享年72歲，法國為他舉行國葬。

巴斯德是法國著名化學(xué)家、微生物學(xué)的奠基人、近代疫苗之父，“不要在已成事業(yè)上逗留”是他的座右銘。他在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、乃至農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都有獨到的發(fā)現(xiàn)與研究，然而使他流芳千古的是病原學(xué)說的創(chuàng)建和免疫預(yù)防接種的發(fā)明。他的貢獻(xiàn)使全人類在過去、現(xiàn)在與將來免受病痛，減少死亡而永久受益[3]。

圖1 路易斯·巴斯德 圖2 約瑟夫·邁斯特 圖3 巴斯德研究所

1 巴斯德科學(xué)生涯的3個年代

巴斯德的科學(xué)研究生涯基本可以劃分為3個年代——化學(xué)科學(xué)年代、生命科學(xué)年代、醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī)學(xué))科學(xué)年代。

1.1 化學(xué)科學(xué)年代

從1843年進入大學(xué)，學(xué)習(xí)化學(xué)，畢業(yè)后獲化學(xué)博士學(xué)位，并在大學(xué)任教，講授化學(xué)，從事晶體的研究。因發(fā)現(xiàn)外消旋酸的立體異構(gòu)體，年輕的巴斯德獲得了英國皇家學(xué)會頒發(fā)的朗德福獎?wù)?，在世界化學(xué)界嶄露頭角。因此在1856年(34歲)前，巴斯德全身心地投入化學(xué)事業(yè)，是一位“純粹”的化學(xué)家。

1.2 生命科學(xué)年代

巴斯德任里爾大學(xué)化學(xué)系主任期間，于1856年開始研究發(fā)酵——一個在釀酒、食品工業(yè)中最普遍存在的問題，開始遇到了微生物，涉及到了有生命物質(zhì)的研究，邁進了生命科學(xué)年代。發(fā)酵問題的研究前后持續(xù)了20年。其間，經(jīng)歷了生命的起源等許多嚴(yán)肅而關(guān)鍵的討論與爭辯。1860年，巴斯德著名的曲頸瓶實驗決定性地否定了微生物自然發(fā)生學(xué)說。至今仍在食品工業(yè)上廣泛應(yīng)用的巴斯德殺菌法也是這個時期的重要成果。

1.3 醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī)學(xué))科學(xué)年代

進入醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī)學(xué))年代顯然是進入生命科學(xué)年代中最重要組成部分，突出表現(xiàn)了巴斯德的研究與人類生命、疾病更為密切的關(guān)系及作出的貢獻(xiàn)。這一階段以蠶病的研究為標(biāo)志，也構(gòu)成了現(xiàn)代傳染病學(xué)的開篇經(jīng)典。

自從中國的養(yǎng)蠶和絲織技術(shù)傳到歐洲后，在法國的南部形成了一個養(yǎng)蠶中心。但有一種蠶瘟在法國蔓延，蠶身上長滿黑色的斑點，病蠶成批死亡。法國的蠶絲業(yè)遭到嚴(yán)重?fù)p失，蠶農(nóng)們請求政府派專家來救治。1865年，法國農(nóng)業(yè)部組建了一個委員會來專門研究這種蠶病。權(quán)威人士杜馬教授提議巴斯德出任該委員會的負(fù)責(zé)人。杜馬教授知道，巴斯德并非是這方面的專家，但他深深地了解他的學(xué)生巴斯德，他的人品，他的勤奮，他的學(xué)識，他的才能，相信只有巴斯德才能擔(dān)當(dāng)解決蠶病的重任。雖然巴斯德知道自己對蠶病一無所知，甚至連一條蠶都沒有見過，出于對杜馬老師的尊敬和對蠶農(nóng)的同情，巴斯德毅然把這件事應(yīng)允下來。他只身來到蠶病重災(zāi)區(qū)阿萊斯(Alais)實地調(diào)查，走訪養(yǎng)蠶場，與蠶農(nóng)交談，邊學(xué)習(xí)養(yǎng)蠶知識、閱讀關(guān)于桑蠶的書，邊查找蠶病的原因。對蠶病的病程有了一個大概的了解。有的蠶第一齡就在蠶架上病死，有的則在第二齡死亡，有的經(jīng)歷第3，第4次脫皮后爬上桑條做繭，蛹變成了蛾，但蛾有病，觸角畸形，腿腳萎縮，翅膀像燒焦似的，這些蛾產(chǎn)的卵，第二年孵化不出健康的蟻蠶。

巴斯德把一間小房改裝成一個簡陋的實驗室。他找來各齡期的蠶，放在顯微鏡下仔細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)多數(shù)蠶身上有胡椒樣的黑點，雖然沒有明顯的病態(tài)，但也屬于病蠶，因為它們吃桑葉時沒有那種“雨打芭蕉”似的沙沙聲。巴斯德進一步把病蠶加水研磨成糊狀，取一滴放在玻璃片上置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有許多橢圓形的棕色微粒，而這種微粒在健康蠶體內(nèi)是找不到的。經(jīng)過幾百次的觀察，巴斯德最后肯定這些橢圓形的微粒就是引起蠶病的病原體。由于這種棕黑斑點像病蠶粘了一身胡椒粉，于是把這種蠶病也通俗地稱為“胡椒病”。

“胡椒病”是一種瘟疫，當(dāng)?shù)匦Q農(nóng)也稱它為蠶瘟。為了證明“胡椒病”的傳染性，巴斯德在桑葉上刷上這種致病的微粒，或?qū)⑸Ｈ~在有病蠶微粒的溶液里浸泡，然后給健康的蠶吃，結(jié)果沒有病的蠶也會出現(xiàn)病態(tài)，先是不愛動，不愛吃，然后在身上起小黑點，直至腐爛。巴斯德觀察到蠶架上的蠶，一旦上面格子的蠶染病，下面一格的蠶很快也會生病，這可能是由于染病的蠶糞掉下去致使下格的蠶發(fā)病。為此，巴斯德把病蠶的糞便一粒一粒地?fù)斐鰜?，放在無病的蠶中間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些無病的蠶也很快出現(xiàn)上述的癥狀。因此，巴斯德認(rèn)定防止蠶病蔓延的第一要著是：切斷傳染源，把病蠶隔離出來。巴斯德推斷棕色微粒的病原在病蠶成蛹至蛾的變態(tài)過程中也會把病原帶入到雌蛾體內(nèi)，巴斯德也將雌蛾加水研磨成糊狀后在顯微鏡下檢查，若發(fā)現(xiàn)有這種微粒，就將雌蛾與其所產(chǎn)的卵一起燒毀；若完全沒有這種微粒，則將其所產(chǎn)的卵留下來，作為來年的蠶種。由于采取了對病蠶的隔離銷毀，以及簡單而嚴(yán)格的檢種措施，保證了健康蠶種的生長與繁殖。經(jīng)過3年(3個盛夏)不分晝夜的工作，巴斯德終于在1868年撲滅了在法國已流行了10余年的蠶瘟，挽救了毀滅邊緣的法國養(yǎng)蠶業(yè)和蠶絲業(yè)。1870年，巴斯德將蠶病的研究成果寫成“蠶病學(xué)”一書出版，作為數(shù)年來防治蠶病的總結(jié)。

巴斯德當(dāng)年研究的這種蠶病，即現(xiàn)在已知的蠶微粒子病(Pébrine)。該病在國外記載的第一次流行是1845年發(fā)生于法國，后來傳遍意大利、西班牙、敘利亞及羅馬尼亞，1865年使法國及意大利的蠶業(yè)陷于絕境。該病的病原為原生動物(Protozona)——微孢子蟲屬(Nosema)的家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)，其生活周期中有孢子、芽體、裂殖子、孢子芽母細(xì)胞等不同發(fā)育階段。孢子卵圓形，大小為(2.0～2.3)μm×(3.6～3.8)μm，巴斯德當(dāng)年在顯微鏡下所見到的微粒即孢子。

傳染病是由病原微生物所引起并能傳播給他人(其它個體)的疾病，古代中外醫(yī)家都曾以不同的名稱記載過傳染病。至于確知傳染病是由于致病性微生物侵入人體所引起的疾病，則系在17世紀(jì)荷蘭生物學(xué)家、顯微鏡學(xué)家安東尼·范·列文虎克(Antony van Leeuwenhoek，1632-10-24～1723-08-26)發(fā)明顯微鏡、并在1676年最先發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌之后的事[4]。19世紀(jì)下半葉，在巴斯德、德國醫(yī)生和細(xì)菌學(xué)家羅伯特·科赫(Robert Koch，1843-12-11～1910-05-27)的引領(lǐng)下，一些重要傳染病的病原體在這一時期相繼被發(fā)現(xiàn)、確認(rèn)和分離出來。雖然也在這一相仿時期，甚或稍早一些，有一些科學(xué)家在防控醫(yī)院感染，在對傳染病防控中的某些環(huán)節(jié)作出過重要貢獻(xiàn)，但僅僅巴斯德，在1865年首次確定一個傳染病的病原體，確定傳染源，傳播途徑，并提出了嚴(yán)密徹底的防控措施，撲滅了在法國已蔓延數(shù)年之久的蠶瘟——家蠶粒子病。雖然這是對一種蠶病的防控，但防控其他獸醫(yī)傳染病、人的傳染病，其原創(chuàng)、其方法都是適用的，可予借鑒的。這些傳染病防控原則，直到今天仍然使用。巴斯德像在其他方面豐功偉績一樣，同樣也是傳染病學(xué)的第一人。對蠶病的研究，成為了現(xiàn)代傳染病學(xué)的開篇經(jīng)典與樣板。

2 巴斯德找到了開啟疫苗大門的鑰匙——控制病原體毒力

巴斯德對雞霍亂疫苗、炭疽疫苗的研制成功，都是通過控制(減弱并穩(wěn)定)相應(yīng)毒力的途徑，可以說是找到了開啟疫苗大門的鑰匙。

2.1 雞霍亂疫苗：偶然發(fā)現(xiàn)自然減毒

1878年，巴斯德開始研究雞霍亂。雞霍亂是由多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)引起的一種急性腐敗性傳染病。19世紀(jì)后期這種禽病在法國嚴(yán)重流行。巴斯德當(dāng)時正進行雞霍亂病理學(xué)的研究。1880年夏天，他分離得到多殺巴斯德氏菌純培養(yǎng)物。他把這種培養(yǎng)菌注射健康雞，成功地誘發(fā)了雞霍亂，從而明確了多殺巴斯德氏菌的病原性意義。

由于每天在肉湯中接種傳代，實驗室的工作臺上排滿了棄置的培養(yǎng)物。瓶子里的雞霍亂培養(yǎng)物應(yīng)該還是活的，不過有些已經(jīng)過了幾周。巴斯德準(zhǔn)備清理一下，并交代助手將這幾滴陳舊的培養(yǎng)物給幾只雞注射一下(這一指令太重要了！巴斯德突然想到了什么？為什么要求助手將本想廢棄的細(xì)菌液給雞注射？)。雞在被注射后立即患病，失去了那種慣常的活躍。第二天卻發(fā)現(xiàn)注射的雞沒有死。巴斯德感到疑惑。因為以前的培養(yǎng)體微生物，是使20只雞死20只。他把這些康復(fù)得奇怪的雞交給管家之后與助手們出外度假。暑假過后，巴斯德需要健康的雞做試驗。由于放假前臨時額外地用去了幾只做陳舊培養(yǎng)液試驗的雞，沒有及時補充準(zhǔn)備新雞，巴斯德就把放假前剩下的新雞全部用上，把曾注射了陳舊培養(yǎng)體染上雞霍亂但康復(fù)的幾只雞也進行接種。助手們將新鮮的雞霍亂微生物的肉湯培養(yǎng)液注射到從未使用過的新雞，也注射到復(fù)了原的雞。次日，注射的新雞都死了，它們原應(yīng)死的；而用陳舊培養(yǎng)體注射之后復(fù)了原的幾只雞，打了同樣致命的劑量，它們完全抵抗住了這個劑量的注射(攻擊)，沒有死，也沒有得病[5]。巴斯德看到這個情境，頓時領(lǐng)悟到其中的緣由，解開了他在放假前見到注射陳舊培養(yǎng)體后的雞為什么不死的疑惑：擱置時間長久的培養(yǎng)體，在瓶子里老起來，微生物老了，就溫馴了，他們給雞染上這病，但只染上了一點兒病，略微的一點兒病，剛好使它們能夠復(fù)原，它一旦恢復(fù)，就能抵抗致命劑量新鮮培養(yǎng)體的注射。這就是巴斯德不同于常人的智慧。一個人，或許也能夠做出同樣意外的實驗，但可能要花費幾年的時間才能對自己說明其奧秘，了解其內(nèi)涵與意義。而巴斯德，從幾只無意中得到保護的雞身上，馬上看見一種防疫物以抵抗毒性微生物的新方法。他見到了勝利的曙光，因為在巴斯德的腦海里充滿著事業(yè)成功的希望。

巴斯德開始了正式的試驗。他把新鮮菌液分別注射到兩組雞身上：一組是以前注射過陳舊菌液而沒有死的那些雞；一組是從來沒有注射過任何菌液的，沒有生過病的雞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，那些沒有注射過任何菌液的雞很快呈現(xiàn)出雞瘟的全部癥狀而死亡；而那些注射過陳舊菌液的雞都安然無恙，它們?nèi)耘f吃食，仍舊追逐嬉戲，只有個別的有些精神不振，但根本不是病態(tài)，過兩天這癥狀就消失了。巴斯德連續(xù)做了5次這樣的實驗，結(jié)果都是一樣。注射過陳舊菌液的雞再接受到新鮮菌液的注射根本不會死亡，它們對雞瘟似乎已經(jīng)適應(yīng)，已有很強的抵抗力。

菌液擱置時間久了，毒性就會減弱，巴斯德以化學(xué)家特有的敏感，認(rèn)為是由于空氣中氧氣的作用。于是他依次把放置幾天的、1個月的、2個月和3個月的菌液分別注射到健康的雞后，雞的死亡率分別是100%，80%，50%和10%。如果注射更久以前的菌液，則雞自然也得病，卻不會死亡。如果再給這些雞注射毒力很大且足以使它們致死的雞瘟菌液時，它具有了抵抗這種疫苗的能力，也可以說雞瘟對這些雞已沒有影響。因此，預(yù)防雞霍亂的辦法找到了，巴斯德成功地發(fā)明了雞霍亂疫苗。

巴斯德發(fā)現(xiàn)的自然減毒的毒力變異理論與方法至今仍然有用，長時間在人工培養(yǎng)基上傳代保存能使某些細(xì)菌的毒力減弱，也成為現(xiàn)在用于誘導(dǎo)細(xì)菌毒力減弱的一種重要方法。最早成功的經(jīng)典例子就是用于免疫預(yù)防結(jié)核病的卡介苗(Bacillus Calmette Guérin，BCG)，以其制備活疫苗，即卡介苗。在巴斯德禽霍亂疫苗成功50年后的1907～1920年間，同樣是在巴斯德研究所的法國細(xì)菌學(xué)家阿爾貝·萊昂·夏爾·卡爾梅特(Albert Léon Charles Calmette，1863-07-12～1933-10-29)和卡米耶·介朗(Camille Guérin，1872-12-22～1961-04-09)，將法國獸醫(yī)學(xué)家、生物學(xué)家埃德蒙·伊西多爾·艾蒂安·諾卡爾(Edmond Isidore étienne Nocard，1850-01-29～1903-08-02)于1901年從患結(jié)核性乳腺炎的奶牛分離到的牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)在膽汁體積分?jǐn)?shù)為0.05的甘油馬鈴薯培養(yǎng)基上，使其生長繁殖，并隔2～3周傳代1次，發(fā)現(xiàn)在此培養(yǎng)基上連續(xù)傳代能夠使其毒力逐漸降低。歷時13年經(jīng)過230余代，經(jīng)動物試驗，牛分枝桿菌完全失去了致病力，從而產(chǎn)生對結(jié)核的免疫力。

巴斯德在雞霍亂疫苗上的成功多少有一點偶然性，但類似的偶然事件在生物學(xué)研究領(lǐng)域中并不少見，20世紀(jì)80年代初，澳大利亞醫(yī)生Barry J Marshall在假期后發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(HelicobacterPylori,HP)生長，與病理學(xué)教授J Robin Warren共同獲得2005年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎[6]。請銘記巴斯德的名言：機遇只偏愛有準(zhǔn)備的人！

2.2 炭疽疫苗的成功：人為減毒變異

由炭疽芽孢桿菌引起的牛和羊的炭疽在19世紀(jì)的歐洲是一種常見流行的嚴(yán)重傳染病。德國細(xì)菌學(xué)家科赫在1876年已宣布檢驗出炭疽的病原菌為炭疽芽孢桿菌，巴斯德用顯微鏡證實了科赫的發(fā)現(xiàn)，還同時發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌具有耐熱性芽孢，對外界環(huán)境有極強的抵抗力，能造成環(huán)境持續(xù)而廣泛的污染。在土壤中能夠長期存活，在干燥的土壤中能存活60年以上。1990年7月，我國湖南省發(fā)生一起因挖樹根暴露了1926年埋葬的死于炭疽的人的尸體，從而感染炭疽，其間隔長達(dá)64年。1970年，在某一國家公園，考古學(xué)家在考古時挖掘出一些骨骸，根據(jù)碳原子測定，約有200年±50年之久，該骨骼經(jīng)培養(yǎng)后分離出炭疽桿菌。Jacotot H 和Virat B于1954年發(fā)現(xiàn)，由巴斯德在1886年制備的炭疽芽孢在68年后仍具有活性[7]?；疾〉哪寥翰冗^的土壤使健康的家畜發(fā)病，牧人把感染炭疽病死的羊埋在地下，經(jīng)蚯蚓或是其它昆蟲把桿菌帶到表土，沾染到草葉上。巴斯德發(fā)現(xiàn)，羊在這些地方吃草，被芒刺植物扎傷一點點，細(xì)菌就會通過這些微傷進入羊的體內(nèi)，使羊很快感染上了炭疽病而死亡。

1881年，巴斯德在研究炭疽疫苗時，繼續(xù)沿用雞霍亂疫苗的原理與方法，即用培養(yǎng)時間較長的炭疽芽孢桿菌的老培養(yǎng)物，對牛、羊做預(yù)防接種，但沒有成功。后來發(fā)現(xiàn)這種處理方法不能使炭疽芽孢桿菌的毒力減弱?，F(xiàn)在知道，這個方法應(yīng)該也是有效的，不過陳舊培養(yǎng)物需要擱置更長的時間。在1907年用芽孢大劑量接種北美松鼠后貯藏于實驗柜內(nèi)，22年后變?yōu)闊o毒。巴斯德后來采用了新的減低毒力的方法，既提高培養(yǎng)溫度來培養(yǎng)炭疽芽孢桿菌，結(jié)果成功了。在防病實踐中人們知道，禽類不受炭疽芽孢桿菌的自然感染，而且巴斯德證明在正常情況下，禽類對實驗性感染也是有抵抗力的。他認(rèn)為家禽對炭疽的抵抗力可能是由于禽類的體溫高的緣故。于是他將雞人工降溫，將雞放在一只四周用冰圍著的桶中，使雞的體溫接近或等于牲畜的體溫，再注射炭疽桿菌于雞體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這樣經(jīng)降溫的雞容易感染，并因典型敗血癥瀕于死亡。巴斯德喜出望外，他馬上抓住炭疽桿菌的作用溫度有關(guān)這一關(guān)鍵進行研究。他發(fā)現(xiàn)在42～43 ℃培養(yǎng)的炭疽芽孢桿菌失去了產(chǎn)生莢膜的能力，毒力也降低了，研制出了弱毒炭疽桿菌疫苗[8]。為了證實炭疽疫苗的預(yù)防接種效果，1881年6月4日在巴黎近郊的普宜(Pouilly le fort)農(nóng)場(后改名為巴斯德莊園)進行了著名的現(xiàn)場示范實驗。共用60頭羊，其中10頭作為對照，25頭預(yù)防接種2次(間隔2周)，另25頭不做預(yù)防接種，幾周后再用強毒力的炭疽芽胞桿菌分別感染上述兩群各25頭羊，結(jié)果未做預(yù)防接種的25頭羊全部死亡，做了預(yù)防接種的25頭均存活無恙。這一示范實驗肯定地證明了弱毒炭疽疫苗的接種對炭疽的預(yù)防作用。采用這種方法使一度給牛、羊帶來毀滅災(zāi)難的炭疽病幾乎完全被控制。巴斯德培養(yǎng)的炭疽芽孢桿菌苗(巴氏Ⅱ號炭疽芽孢苗)至今仍在使用。

3 狂犬病疫苗的成功：開啟了一個疫苗時代

巴斯德對狂犬病疫苗的研究成功，也是通過控制(減弱并穩(wěn)定)相應(yīng)毒力的途徑，但自此可以說是開啟了一個疫苗時代。

3.1 狂犬病毒在哪里

巴斯德在成功了雞霍亂疫苗、炭疽疫苗之后，于1882年開始進行預(yù)防狂犬病的研究。現(xiàn)在已知，狂犬病是由狂犬咬人時狂犬病毒(Rabies virus)隨唾液進入被咬機體引起的，但在巴斯德開始研究狂犬病時，病毒尚未被發(fā)現(xiàn)。病原是什么，它在哪里，一切都不知道，一切從零開始。巴斯德明白要研制出像雞霍亂、炭疽病的減毒疫苗的首要條件是分離到病原體。因此，巴斯德的第一步是要找到狂犬病原體。

巴斯德首先選擇了從狂犬的唾液中尋找。既然狂犬咬人時，能將人感染，那么狂犬的唾液中必定存在有狂犬病原體。要想以狂犬為對象進行實驗，其困難是可想而知的?？袢刻炜穹筒恢?，時刻危脅著每一個靠近它的人。為了攝取它的唾液，巴斯德的助手們先用繩子套住瘋狗的頭，然后抓住它的四條腿強行提出籠來，硬是把它按到實驗桌上，掰開了滿是唾沫的嘴巴。巴斯德手里拿著管子，將管子的一頭送進狂怒的瘋狗的嘴巴，另一頭則含在自己的嘴里，用力吸氣，以便將瘋狗的唾液盡可能多的吸進管子里。此時，巴斯德的胡子幾乎湊近到離狗頭只有幾英寸的地方了[9]。巴斯德和他的助手們早已把自己可能遭到的危險完全置之度外了。

巴斯德將瘋狗的唾液接種給家兔，能夠在家兔復(fù)制出狂犬病，但是在顯微鏡下見不到，可以利用的各種分離和培養(yǎng)細(xì)菌的方法都試過了，就是得不到毒性巨大的狂犬病病原體。巴斯德確定這種具有侵染性的病原體是一種極微小的微生物，巴斯德稱其為“Virus”。Virus一詞，作為微生物學(xué)名詞，有3種解釋：病毒，傳染毒，濾過性病原體(新英漢詞典，1978)。帶有“Virus”的詞一般均具有“毒”的含義(如Virulence，毒力)。巴斯德可能是病毒發(fā)現(xiàn)之前，第一個將現(xiàn)在已知為病毒(Virus)的病原微生物稱為“Virus”的科學(xué)家。“Virus”一詞引入中國后，曾譯為“毒素”，“微子”，后來改稱為“病毒”，即能致病的毒物[10]。

巴斯德觀察與分析了實驗狂犬的發(fā)病過程，認(rèn)為狂犬病是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要特征，因此確信狂犬病毒不是通過血液發(fā)生作用的，而是通過神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生作用。只要病毒尚未深入到中樞神經(jīng)，它就可能在身體的其他部位潛伏起來，甚至可以停留幾個月或幾年之久，這就是常說的潛伏期。在病毒沒能達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前，被咬者便可以僥幸地活著。為了進一步驗證，巴斯德把瘋狗身上的血液抽出來，然后注入健康的狗體內(nèi)，結(jié)果被注射的狗根本沒有發(fā)病。這一結(jié)果表明巴斯德的推斷完全正確——狂犬病毒不在血液里。那么，是否存在于瘋狗的腦髓中呢？巴斯德做了開顱接種的實驗。他將麻醉后的狗綁在手術(shù)臺上，用環(huán)鋸揭去一小塊圓形的顱骨后，露出腦膜，然后在腦膜上注射了少量的瘋狗的腦髓，最后縫合傷口。狗恢復(fù)知覺后看上去健康如常，但在14 d后出現(xiàn)了狂犬病的癥狀，最后癱瘓死去。該實驗證明了狂犬病毒存在于瘋狗的腦髓中。雖然看不到狂犬病毒，也沒有分離到，但巴斯德終于得到了可靠證據(jù)——可以利用的集中含有巨大毒性的狂犬病毒載體——瘋狗腦髓。

3.2 兔腦傳代與干燥減毒

巴斯德獲得了含有強大毒力的，患狂犬病的狗的腦髓材料后，為了有效而可靠地保存毒力巨大的狂犬病毒菌種，便于開展持續(xù)的研究，巴斯德改用兔腦接種傳代保種。他把兔子的腦蓋揭開，注射入瘋狗的延髓液，過了18 d，兔子發(fā)病死亡。兔子死后，巴斯德迅速取出其延髓液，移入另一只活兔子的腦中。兔對狂犬病毒十分敏感。在傳代接種過程中發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，兔發(fā)病的潛伏期逐漸縮短，說明狂犬病毒隨著兔腦傳代毒力逐漸增強。連續(xù)傳代9次時，其潛伏期由15～20 d縮短至6～7 d。潛伏期可以作為衡量病毒對兔毒力的評判標(biāo)準(zhǔn)。巴斯德此時創(chuàng)立了直至現(xiàn)在仍在狂犬病毒研究中奉為經(jīng)典的街毒與固定毒的理論。

巴斯德把從自然感染的瘋狗中獲取的病毒稱為街毒(street virus)，街毒對人毒力強，而對家兔毒力弱。當(dāng)把街毒接種到家兔腦內(nèi)，需經(jīng)14～21 d或更長時間的潛伏期后產(chǎn)生疾病。通過對家兔的連續(xù)傳代后，對兔的毒力增加，潛伏期逐漸縮短，直到最終兔能恒定地在第6天或第7天發(fā)病和在第9天或第10天死亡，此時成為固定毒(Fixed virus)[11]。固定毒對兔已達(dá)到了高度恒定的毒力，而對犬喪失了毒力。在街毒感染的腦各部位的細(xì)胞內(nèi)，能發(fā)現(xiàn)有包涵體，也稱內(nèi)基氏(Negri)小體，尤以海馬角的錐體細(xì)胞與小腦中的普肯野氏(Purkinje)細(xì)胞內(nèi)最多，是狂犬病毒生長繁殖的場所，而固定毒接種后，都不見包涵體。固定毒部分喪失了沿神經(jīng)傳播能力，不侵入唾液腺。

巴斯德在雞霍亂疫苗中十分注意空氣中氧對微生物毒力的作用，認(rèn)為氧化使細(xì)菌毒力減弱；巴斯德也極其推崇時間對減低毒力的影響，雞霍亂疫苗的減毒與保存時間的長短成正比關(guān)系。在炭疽疫苗中的關(guān)鍵影響因素是溫度，提高了溫度的培養(yǎng)使強大毒力的炭疽芽孢桿菌變成了弱毒。巴斯德可能總結(jié)分析了雞霍亂疫苗，炭疽疫苗的成功經(jīng)驗，對已成為固定毒的兔脊髓創(chuàng)造了黑暗恒溫環(huán)境中直接暴露空氣14 d自然干燥逐日減毒法，來再次降低毒力。

巴斯德首先從死于狂犬病的家兔的腦橋或脊髓取得新鮮固定毒，并制成乳劑，取幾滴乳劑注射于健康兔的硬腦膜下。一切操作必須嚴(yán)格無菌，以排除其他感染。試驗家兔將于第6天或第7天開始出現(xiàn)癥狀，在第9天或第10天死亡。通常在讓病兔自然死亡，在瀕死前使用氯仿，以免最終感染和免除病兔不必要的痛苦。當(dāng)動物一死亡，立即在消毒液內(nèi)洗滌并解剖取出脊髓，并利用消毒過的細(xì)絲懸掛在預(yù)先消毒過的瓶子內(nèi)，瓶底復(fù)以一塊KOH作為干燥劑，置于20～22 ℃的暗室中，脊髓逐漸地在這樣的環(huán)境中脫水干燥了14 d。脊髓經(jīng)干燥變?yōu)榭菸舅烙诳袢⊥米拥募顾柙?jīng)是極毒的，發(fā)現(xiàn)干燥14 d的含毒病兔脊髓失去了腦內(nèi)感染家兔的能力，這樣便使原來已成為固定毒的毒力又被減弱了。1884年，巴斯德用經(jīng)干燥處理的含毒病兔脊髓以生理鹽水做成懸液注射給23條健康犬進行免疫試驗，采用的方法是用少量這種“兔苗”逐日給健康犬注射，最初注射經(jīng)干燥14 d的含毒病兔脊髓，最后一針僅注射干燥1 d的含毒病兔脊髓，即共注射14次(天)。結(jié)果經(jīng)注射接種過的健康犬在被瘋狗咬傷后沒有感染狂犬病，因而證明了健康犬通過接種能獲得狂犬病的免疫性。

3.3 狂犬疫苗的第一次人體接種

1885年，巴斯德的研究成果見報后，立即引起了轟動。7月6日，9歲男孩約瑟夫·邁斯特由家人陪同，從法國東北部的阿爾薩斯(Alsace)地區(qū)來到巴黎，找到巴斯德實驗室，約瑟夫在2 d前遭到一只瘋狗的襲擊，全身有14處很深的咬傷，已經(jīng)幾乎不能行走了。雖然巴斯德對狂犬病疫苗在狗身上實驗的成功很有信心，但現(xiàn)在面對的是人，一個男孩。他非常慎重地考慮應(yīng)不應(yīng)該在這個男孩身上注射疫苗。巴斯德咨詢了兩位醫(yī)生，他們都認(rèn)為如果什么都不做，他極有可能會犯上狂犬病，肯定會死。于是巴斯德決定注射疫苗。當(dāng)天晚上(距咬傷60 h)，就由助手給約瑟夫注射了第一針，這是干燥了14 d的含毒病兔脊髓的生理鹽水懸液。按照預(yù)先制定的免疫接種順序，先是從干燥貯存時間最長，也就是毒力最弱的疫苗開始。第二次是用干燥13 d的脊髓，后一針比前一針更為新鮮的疫苗，總共注射了13針，其中最后5針含有大量的活病毒[12]。7月16日，約瑟夫打了最后一針，接種材料取自死后僅1 d的兔子。治療十分成功，巴斯德疫苗的免疫保護使約瑟夫免患狂犬病，巴斯德拯救了被瘋狗咬傷的人。1885年7月6日，這是人類歷史上值得永久紀(jì)念的日子，巴斯德發(fā)明的世界上第一支疫苗，狂犬疫苗首次用于人體，治療獲得成功?？袢∫呙绯晒α耍_創(chuàng)了人類征服傳染病的新紀(jì)元，開啟了一個嶄新的疫苗時代。

被巴斯德挽救的第一例狂犬病患者約瑟夫·邁斯特，長大以后成為了巴斯德研究所的守門人，忠實守護著巴斯德的墓園。1940年，納粹德國侵占巴黎，納粹侵略者強迫約瑟夫·邁斯特開啟巴斯德墳?zāi)沟拈T，但被邁斯特拒絕了，用死來抗議，他開槍自盡。

3.4 巴斯德預(yù)防治療法

狂犬病疫苗的成功，轟動了整個世界，人們紛紛把病人送到巴黎，送到巴斯德實驗室(巴斯德研究所落成于1888年)，這個世界上唯一能拯救狂犬病人的地方。巴斯德制定免疫程序表，稱為“Pasteur prophylactic treatment”(巴斯德預(yù)防治療法)。

至1886年4月不到1年的時間內(nèi)，預(yù)防治療被瘋狗咬傷者688人，僅1例無效死亡；被瘋狼咬傷者38人，有3例死亡。至1886年10月治療人數(shù)達(dá)2 470人，其中在法國和阿爾及利亞暴露治療1 726人中，10例因病情延誤而免疫失敗。巴斯德估計失敗的幾率是1/170。失敗者多為頭面部或四肢深部咬傷的兒童。到1935年為止，約有51 057人在巴斯德研究所(巴黎)進行了接種，死亡率約為0.29%，即總共有151人死亡[13]。在預(yù)防治療第一例狂犬病后的次年(1886年)，巴斯德研究所就接納了2 671例，在1886～1914年的28年中，共接納33 490例，死亡129例，總的治療率達(dá)99.615%。無效死亡率為0.385%，除在頭3年死亡率超過0.5%以外，其余26年死亡率都在平均數(shù)以下，在1912～1914年連續(xù)3年，均無死亡病例發(fā)生。而當(dāng)時被瘋狗咬后死于狂犬病的人在6%～10%，有時達(dá)16.6%，甚至更高。在Taudieu 收集到瘋狗咬傷的855人中，死亡399人，死亡率為46.6%；Bouley報告在瘋狗咬傷的266人中152人發(fā)病死亡，死亡率為57.1%，在臉部和手被咬傷更具危險。被狼咬傷的死亡率達(dá)60%～80%。

巴斯德減毒的狂犬病固定毒毒株保存于巴黎與世界各地許多實驗室，并衍化生成了具有不同特性的PV，PAS，PM，CVS，AVO1等多種疫苗株[14,15]。用這種病毒制造疫苗，一直保持到現(xiàn)在。巴斯德創(chuàng)立的固定毒原理，狂犬病暴露后治療及多次接種程序的巴斯德預(yù)防治療法仍為狂犬病疫苗制備研究的經(jīng)典。1899年，在巴斯德狂犬病首次人體接種后14年，這種當(dāng)時世界上最先進的疫苗，即在我國上海引進應(yīng)用。1899～1922年，我國即采用巴斯德原法制造疫苗[16]。1931年，北平衛(wèi)生事務(wù)所袁浚昌從一捕獲的狂犬腦中分離出1株狂犬病病毒，經(jīng)當(dāng)時的中央防疫處長齊長慶、李嚴(yán)茂通過家兔腦內(nèi)傳代演變成固定毒，稱北京狂犬病固定毒[17]。于1933年始用北京株生產(chǎn)羊腦疫苗，持續(xù)使用近50年，直至1980年停用。1965年武漢生物制品研究所林放濤先生在北京株固定毒基礎(chǔ)上培育疫苗aG株[18]。中國食品藥品檢定研究院嚴(yán)子林先生在1956年從山東博山一狂犬病死者腦中分離的街毒，經(jīng)小鼠連續(xù)傳代56代時，發(fā)病潛伏期從11～14 d縮短至3～6 d，為固定毒，又經(jīng)KMB-17人二倍體細(xì)胞連續(xù)傳代37代，獲得狂犬病病毒二倍體細(xì)胞適應(yīng)株，正式命名為中國濟南1號(CTN-1)[19]。適用于疫苗生產(chǎn)，已獲WHO第7次狂犬病專家委員會認(rèn)可作為疫苗種子毒。雖然現(xiàn)今狂犬病疫苗以多種更完善的形式不斷地推陳出新[20]，但狂犬病疫苗仍然遵循著巴斯德確定的原則與方向在不斷前進。

疫苗在人類歷史上創(chuàng)造的奇跡，顯示了科學(xué)以無窮的力量改變著人類的命運，也使千百年來肆虐于世間的各種傳染病不斷被人類所征服。但不為多數(shù)人們所熟知的是，其中凝結(jié)著無數(shù)科學(xué)家的聰明智慧和辛勤汗水。其中最值得推崇和敬仰的兩位偉大的科學(xué)家是英國鄉(xiāng)村醫(yī)生(也被譽為自然歷史學(xué)家、免疫學(xué)家、醫(yī)學(xué)家)愛德華·琴納(Edward Jenner，1749-05-17～1823-01-26)和路易斯·巴斯德，其中琴納首先發(fā)明了天花疫苗，是他們開啟了預(yù)防醫(yī)學(xué)和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)新時代的大門。我們今天在使用疫苗預(yù)防傳染病的時候，不能忘記也永遠(yuǎn)不會這兩位偉大科學(xué)家的歷史功德。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Commemoration of the 130th Anniversary for Louis Pasteur Inventing Rabies Vaccine

YANG Zheng-shi1,2，F(xiàn)ANG Hai2,3

(1 National Institute for the Control of Food and Drug, Beijing,100050;2 Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine;3 Department of Animal Science & Veterinary Medicine,Hebei Normal University of Science & Technology;China)

Louis Pasteur (1822～1895) was a great France scientist. He invented rabies vaccine, and successfully inoculated it to Joseph Meister, a boy serious bite by a mad dog in July 6, 1885, from then on, people took that day as a beginning point of vaccine era conquering infectious diseases, and it has been 130 years since then. Pasteur’s scientific career could be divided into three periods: 1.Chemistry period(before 1856); 2.the era of the life sciences (started in 1856 when contacted with microorganism fermentation); 3.the medical/veterinary era(marked by silkworm disease research). Pasteur contributed in many fields including chemistry, life sciences, medicine and agricultural sector, especially in the creation of prophylactic immunization invention and etiology theory. In exploring the vaccines, Pasteur found the key to vaccine——control the virulence of pathogens. He found Pasteurella multocida which could naturally attenuated chicken cholera pathogenic bacteria and made Bacillus anthracis virulence variation occur artificially. He successfully developed attenuated fowl cholera vaccine and anthrax vaccine. He established classical fixed virus theory through rabbit brain passage transfer, and developed a safe and effective rabies vaccine and the Pasteur prevention therapy. Although rabies vaccine kept changing for centuries, the principle is still under the guide of the Pasteur theory.

Louis Pasteur;rabies vaccine；preventive veterinary medicine

2015-11-15

10．3969/J．ISSN．1672-7983．2015．04．001

S813.25

A

1672-7983(2015)04-0001-08

楊正時(1938-)，男，研究員。主要研究方向：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)，生物制品和傳染病控制。