馮曉燕 陳瑩 劉玉鵬 王春鵬 儲(chǔ)富祥

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042)

聚乙二醇-金納米棒介導(dǎo)的近紅外光熱抑菌作用

馮曉燕 陳瑩＊?jiǎng)⒂聩i 王春鵬 儲(chǔ)富祥

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042)

種子生長(zhǎng)法合成縱向表面等離子體共振吸收峰為785 nm的金納米棒，并對(duì)其表面進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾，研究了表面修飾PEG的金納米棒(polyethylene glycol modified gold nanorods，PEG-GNR)的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)，并測(cè)試了其細(xì)胞毒性。以革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌及銅綠假單胞菌為細(xì)菌模型，詳細(xì)研究了PEG-GNR在808 nm波長(zhǎng)近紅外激光照射下金納米棒濃度和照射功率對(duì)抑菌效果的影響。結(jié)果表明，PEG-GNR對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在近紅外照射下均有較好的抑菌效果，并且抑菌效果與金納米棒的濃度和照射功率有著密切的關(guān)系；結(jié)合熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)細(xì)菌壞死狀況的觀察，初步證實(shí)細(xì)菌對(duì)PEG-GNR有效吸收是近紅外光熱殺菌的關(guān)鍵因素。

金納米棒；PEG修飾；光熱抑菌

細(xì)菌的耐藥性已成為全球醫(yī)療領(lǐng)域中倍受關(guān)注的問(wèn)題，多藥耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[1-2]。人們?yōu)E用抗生素導(dǎo)致多藥耐藥細(xì)菌的種類(lèi)越來(lái)越多，現(xiàn)有抗菌藥物的療效越來(lái)越小，這是人類(lèi)公共保健領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)之一。激光光熱療法是利用外加能量在含有病變的組織中產(chǎn)生一定范圍的高溫，達(dá)到殺死病原體細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞的目的[3-6]，由于沒(méi)有特異性的靶目標(biāo)，因而不易產(chǎn)生耐藥性。用于光熱療法的激光主要使用可見(jiàn)光激光，但由于該波段激光對(duì)組織的穿透有限，因此激光熱療法具有一定的局限性[7]。近年來(lái)研究報(bào)道，利用光熱轉(zhuǎn)換材料，如有機(jī)光熱染料吲哚菁綠或者貴金屬和碳納米材料，能夠選擇性地增強(qiáng)病變部位的熱損傷從而提高治療效果[8-11]。眾所周知，金納米棒是一類(lèi)經(jīng)典的光熱轉(zhuǎn)換材料，具有合適比率的金納米棒在近紅外區(qū)域?qū)す饽芰坑袕?qiáng)烈的吸收效應(yīng)，選擇與金納米棒縱向表面等離子共振(LSPR)波長(zhǎng)相匹配的近紅外激光作為光源，能夠誘導(dǎo)皮下深層組織的金納米棒顆粒產(chǎn)生熱效應(yīng)，促使細(xì)胞致死[11-13]。由于生物組織在近紅外區(qū)的光吸收很弱，金納米棒因其獨(dú)特的近紅外光吸收性和光穩(wěn)定性，能有效地代替光吸收染料在激光熱療中的應(yīng)用。近年來(lái)，金納米棒在腫瘤治療光熱療法等方面得到了廣泛的關(guān)注和研究[14-16]，相比之下，金納米棒在抗菌感染光熱療法的報(bào)道卻很少見(jiàn)。由于激光光熱療法的抑菌機(jī)理與普通小分子抗生素的抑菌機(jī)理有著顯著的不同，因此研究金納米棒的近紅外光熱抑菌對(duì)于探索和解決細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題有著十分重要的意義。鑒于此，本研究通過(guò)種子生長(zhǎng)法制備獲得了縱向等離子體峰為785 nm的金納米棒，并用mPEG5000-SH對(duì)其進(jìn)行了表面修飾，制備在生理?xiàng)l件下更穩(wěn)定并有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的聚乙二醇修飾的金納米棒(PEG-GNR)，研究了在近紅外光照射下PEG修飾的金納米棒對(duì)各種測(cè)試菌(包括革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：氯金酸(HAuCl4)、硼氫化鈉(NaBH4)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、硝酸銀(AgNO3)抗壞血酸、巰基化的聚乙二醇(mPEG5000-SH)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；活死?xì)胞試劑盒(LIVE/DEAD BacLight kit，美國(guó))；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus，CICC10384)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus，B.cereus，CICC10352)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli，CICC10354)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa，CICC10351)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1800 SPECTROPHOTOMETER，上海美譜達(dá))、透射電子顯微鏡(TEM JEOL-1010，日本)、酶標(biāo)儀(ChroMat4300，美國(guó))、Zeta電位分析儀(Zetasizer nano-ZS，MALVERN，英國(guó))、近紅外光激光器(LE-LS-808-3000TFCA，深圳理歐光電公司)、熒光顯微鏡(Olympus X81，日本)。

1.2 聚乙二醇(PEG)修飾金納米棒(PEG-GNR)的制備

金納米棒溶液的制備[17]：6.25 mL二次蒸餾水中分別加入100 μL HAuCl4(0.01 mol·L-1)溶液，1.88 mL CTAB(0.2 mol·L-1)溶液，混合均勻后，再加入0.5 mL NaBH4(0.01 mol·L-1)溶液，加完后劇烈搖晃，得到棕黃色的溶液，即為金納米棒的種子溶液，將它置于30℃恒溫條件下靜置2 h，待用。在另一容器中分別加106.9 mL的二次蒸餾水，7.425 mL HAuCl4(0.01 mol·L-1)溶液和106.4 mL CTAB(0.2 mol·L-1)溶液，混合均勻后加入1.35 mL AgNO3(0.01 mol·L-1)和1.35 mL抗壞血酸(0.1 mol·L-1)溶液，該溶液為生長(zhǎng)液，待此溶液變?yōu)闊o(wú)色后，加入1.8 mL上述金納米棒的種子溶液，混合均勻，30℃恒溫條件下靜置過(guò)夜，即得金納米棒溶液(CTAB-GNR)。將所得的金納米棒溶液置于4℃條件下靜置4 h，析出溶液中多余的CTAB分子，然后通過(guò)高速離心處理去除溶液中殘余的自由CTAB分子，并將溶液濃縮30倍(原子吸收光譜測(cè)得金溶液濃度最終為160.5 μg·mL-1)，超聲分散后與巰基化的聚乙二醇(mPEG5000-SH)溶液混合，mPEG5000-SH的最終濃度為2.0 mg·mL-1，靜置，過(guò)夜。最終所得的棕紅色溶液即為聚乙二醇(PEG)修飾的金納米棒(PEG-GNR)溶液，備用。

1.3 PEG-GNR的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)的測(cè)定

將制得的PEG-GNR溶液用二次蒸餾水稀釋到金濃度分別為2.41、3.21、4.82和9.63 μg·mL-1，各取1 mL溶液，用波長(zhǎng)為808 nm的近紅外光激光照射上述各個(gè)濃度的PEG-GNR溶液22 min，定時(shí)記錄溶液的溫度，繪制近紅外光熱轉(zhuǎn)換曲線(xiàn)。

1.4 PEG-GNR體外細(xì)胞毒性測(cè)試

利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測(cè)試CTAB-GNR和PEG-GNR的細(xì)胞毒性。首先將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3細(xì)胞)接種于96孔板，24 h后，把CTAB-GNR和PEGGNR溶液分別按照10，15，20，25和30 μL的體積分別加到各組細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，4 h后分別向各孔加入150 μL DMSO溶液，最后使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 PEG-GNR抑菌實(shí)驗(yàn)

配置新鮮測(cè)試菌(金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌及銅綠假單胞菌)溶液，調(diào)節(jié)細(xì)菌密度約為106CFU·mL-1。在96孔板各個(gè)測(cè)試孔中加入100 μL上述菌液，然后在不同的培養(yǎng)組中分別加入3、4、6、12 μL的PEG-GNR(160.5 μg·mL-1)溶液之后，補(bǔ)充一定體積的培養(yǎng)液使每個(gè)培養(yǎng)孔中的液體體積固定為200 μL。設(shè)置空白對(duì)照組、金納米棒組和金納米棒照射組(1 W和2 W)，每組3復(fù)孔，于恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用設(shè)定的輸出功率近紅外激光照射，每孔5 min，然后37℃再培養(yǎng)18 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)試各孔的600 nm處的吸光值(OD600nm)。

1.6 細(xì)菌壞死實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

取1 mL新鮮大腸埃希氏菌菌液(106CFU· mL-1)，加入50 μL PEG-GNR(160.5 μg·mL-1)溶液，37℃恒溫條件下培養(yǎng)2 h，高速離心處理去除培養(yǎng)液后用已消毒處理二次蒸餾水稀釋分散至1 mL。取200 μL上述菌液加96孔板中，用808 nm波長(zhǎng)的近紅外激光(1 W)照射5 min后，利用活死細(xì)菌染色試劑盒(LIVE/DEAD BacLight kit)對(duì)活死細(xì)菌進(jìn)行染色，室溫避光靜置15 min后，取10 μL溶液用于熒光顯微鏡觀察。

1.7 細(xì)菌表面吸附情況檢測(cè)

取2mL新鮮大腸埃希氏菌菌液(108CFU·mL-1),高速離心去除上層培養(yǎng)液，用已消毒處理的二次蒸餾水將其稀釋分散至1 mL后，加入0.3 mL PEGGNR(160.5 μg·mL-1)溶液，37℃恒溫條件下培養(yǎng)2 h。使用透射電子顯微鏡專(zhuān)用銅網(wǎng)制備樣品并在室溫條件下晾干，在透射電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG-GNR的制備

圖1 (A)CTAB穩(wěn)定的金納米棒透射電鏡圖片;(B)表面修飾PEG的金納米棒透射電鏡圖片(C)CTAB穩(wěn)定的金納米棒及表面修飾PEG的金納米棒的紫外吸收光譜圖Fig.1(A)TEM image of CTAB-gold nanorods;(B)TEM image of PEG-GNR;(C)UV-Vis spectra of CTAB-GNR and PEG-GNR

本研究采用“晶種生長(zhǎng)”(種子生長(zhǎng))的方法，使用高濃度的CTAB(0.2 mol·L-1)為模板劑和穩(wěn)定劑制備了CTAB分子穩(wěn)定的金納米棒。圖1A為制備的金納米棒的透射電子顯微鏡照片，顯示其平均長(zhǎng)度約為42 nm，寬約為11 nm，長(zhǎng)徑比約為3.8∶1；由紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(圖1C)數(shù)據(jù)可知其橫向表面等離子體共振吸收峰(TSPR)為525 nm，縱向表面等離子體共振吸收峰(LSPR)為785 nm，因此已達(dá)到了近紅外區(qū)。由于在金納米棒的制備過(guò)程中，使用了大量的表面活性劑CTAB，自由的CTAB分子對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)等生物分子具有生物毒性，限制了金納米棒在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[18-20]。本研究中為了消除CTAB的毒性影響和增加金納米棒的生物相容性，采用巰基化的聚乙二醇(mPEG5000-SH)修飾金納米棒。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，相對(duì)于其他一般功能鍵，金屬-巰基鍵的鍵合力較強(qiáng)，生物分子聚乙二醇可以功能化一個(gè)脂肪巰基作為連接鏈，通過(guò)Au-S鍵鍵合到金納米棒上，可以使去除CTAB的金納米棒保持穩(wěn)定[5,21]。由圖1B觀察到金納米棒經(jīng)過(guò)mPEG5000-SH分子修飾后的金納米棒基本保持原有的形貌，紫外可見(jiàn)吸收光譜數(shù)據(jù)顯示金納米棒在與mPEG5000-SH鍵合反應(yīng)后，其橫向和縱向表面等離子體共振吸收峰發(fā)生輕微藍(lán)移，這是由于金納米棒周?chē)娜芤涵h(huán)境發(fā)生變化引起折射系數(shù)改變[22]，但mPEG5000-SH對(duì)金納米棒的修飾后并沒(méi)有改變金納米棒特有的光學(xué)性質(zhì)。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道PEG在金納米棒表面不能完全替代CTAB分子[23]，但是本研究中5 000分子量的PEG有一個(gè)10 nm的水合長(zhǎng)度，這比CTAB的雙分子層長(zhǎng)[24]，聚合物的刷子構(gòu)像可以在未取代的CTAB外面形成一個(gè)交聯(lián)層，這樣就減少了正電的CTAB潛在的非特異性蛋白吸附，不但增強(qiáng)了金納米棒的生物相容性，還可以在高離子強(qiáng)度的環(huán)境中穩(wěn)定納米棒[25]。為了進(jìn)一步證實(shí)PEG對(duì)金納米棒的成功修飾，通過(guò)測(cè)試金納米棒修飾前后的ζ電位，發(fā)現(xiàn)修飾后的金納米棒的表面電荷由原來(lái)的+40.3 mV降低到+19.6 mV，也就是說(shuō)金納米棒表面的大部分的帶有正電荷的CTAB分子被無(wú)電荷PEG取代，屏蔽了一部分正電荷，使得金納米棒的表面電荷降低。經(jīng)過(guò)PEG修飾的金納米棒溶液可以保持兩周以上的穩(wěn)定存在，并且其特有的光學(xué)性質(zhì)也保持不變。

2.2 PEG-GNR的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)

為了進(jìn)一步證實(shí)PEG表面修飾后的金納米棒具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，我們研究了不同濃度的PEG-GNR溶液的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)。圖2A和B分別為1 mL不同濃度的PEG-GNR溶液(9.63、4.82、3.21、2.41 μg·mL-1)在輸出功率為1 W和2 W，照射面積為0.385 cm2，波長(zhǎng)為808 nm的近紅外激光照射下溶液溫度與照射時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)。如圖2所示，各濃度的PEG-GNR溶液在近紅外激光照射下立即產(chǎn)生熱效應(yīng)，表現(xiàn)為溶液溫度逐步升高；溫度的升高大致可分為3個(gè)階段，首先是快速升高，然后逐漸變緩，最后保持不變。值得注意的是，溶液溫度的變化幅度是隨著PEG-GNR溶液的濃度和激光照射功率的增大而增大的。當(dāng)激光器的輸出功率為2 W，金納米棒的濃度高于4.82 μg·mL-1時(shí)，溶液照射后的最高溫度可達(dá)到60℃以上。由此看來(lái)，通過(guò)改變PEG-GNR溶液的濃度、激光照射功率或者激光照射時(shí)間，可以控制金納米棒的光熱轉(zhuǎn)換速度及升溫幅度，促使局部過(guò)高熱，從而達(dá)到所需的理想有效的殺菌和抑菌效果。

2.3 PEG-GNR體外細(xì)胞毒性

利用MTT法我們?cè)u(píng)估了PEG-GNR的體外細(xì)胞毒性，分別測(cè)試了不同體積用量的PEG-GNR和CTAB-GNR溶液對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞的相對(duì)存活率的影響。由圖3可知，在PEG-GNR各體積用量下，細(xì)胞的存活率都基本維持在90%以上，即使當(dāng)用量為30 μL時(shí)，NIH/3T3細(xì)胞仍然具有很高的細(xì)胞存活率。而相對(duì)應(yīng)的未經(jīng)PEG修飾的CTAB穩(wěn)定的金納米棒，它對(duì)NIH/3T3細(xì)胞具有較高的毒性，細(xì)胞存活率很低。這一結(jié)論說(shuō)明，經(jīng)過(guò)PEG對(duì)金納米棒表面的修飾，能夠大大改善金納米棒的細(xì)胞毒性，有利于金納米棒的進(jìn)一步生物利用。

圖2 PEG-GNR在近紅外激光輸出功率為(A)1 W和(B)2 W時(shí)的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)曲線(xiàn)Fig.2Photothermal conversional effect curve of PEG-GNR under the radiation of NIR laser with the output power(A)1 W and(B)2 W

圖3 PEG-GNR和CTAB-GNR對(duì)細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性Fig.3In vitro cytotoxicity of PEG-GNR and CTAB-GNR against NIH/3T3 cells

2.4 近紅外光照對(duì)細(xì)菌的抑制作用

為了考察PEG-GNR在近紅外激光照射后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，本研究選取大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性菌測(cè)試模型，金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌測(cè)試模型，詳細(xì)研究了PEG-GNR溶液對(duì)這4種菌的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了空白對(duì)照組(Control)，金納米棒無(wú)激光照射組(PEG-GNR group)，激光輸出功率為1 W的金納米棒激光照射組(1 W NIR group)和輸出功率為2 W的金納米棒激光照射組(2 W NIR group)4個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試組?？紤]到細(xì)菌對(duì)PEG-GNR的吸附或者胞吞需要一定時(shí)間，在激光照射前對(duì)細(xì)菌和PEGGNR溶液進(jìn)行了預(yù)先共培養(yǎng)2 h，確保細(xì)菌細(xì)胞對(duì)PEG-GNR的有效吸收和吸附。圖4是不同測(cè)試菌與PEG-GNR溶液(9.63 μg·mL-1)共培養(yǎng)2 h后，激光照射5 min后再培養(yǎng)18 h的菌液OD600nm吸光值對(duì)比圖。如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，金納米棒無(wú)激光照射組OD600nm吸光值僅僅略微減小，表明PEG修飾的金納米棒本身在無(wú)激光照射的情況下對(duì)各類(lèi)細(xì)菌僅有微弱的抑制生長(zhǎng)作用，但并未達(dá)到完全抑菌的效果。然而另一方面，金納米棒激光照射組卻表現(xiàn)出對(duì)所有測(cè)試菌株都具有較好的抑制生長(zhǎng)效果。圖4中，兩組激光照射組(1 W和2 W)無(wú)論是對(duì)革蘭氏陰性測(cè)試菌還是革蘭氏陽(yáng)性測(cè)試菌均表現(xiàn)出極顯著的抑菌效果，激光照射后再培養(yǎng)18 h，溶液OD600nm的吸光值仍然幾乎為零，也就是說(shuō)測(cè)試菌與金納米棒共培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)1 W(或以上)激光照射后幾乎不再生長(zhǎng)。根據(jù)圖4的結(jié)果，當(dāng)PEG-GNR溶液濃度為9.63 μg·mL-1時(shí)，輸出功率為1 W的激光照射5 min即可達(dá)到理想的抑菌效果。

2.5 PEG-GNR溶液濃度對(duì)抑菌效果的影響

圖5A和B為激光照射輸出功率分別為1 W和2 W時(shí)，不同濃度的PEG-GNR溶液對(duì)各種測(cè)試細(xì)菌的抑制生長(zhǎng)的情況。由圖可見(jiàn)，隨著濃度的增加PEG-GNR抑菌作用更加明顯。表1中總結(jié)了2種照射功率下PEG-GNR對(duì)測(cè)試菌的最低抑制濃度(MIC，μg·mL-1)。結(jié)果表明，PEG-GNR溶液濃度和激光照射功率對(duì)細(xì)菌的抑菌效果都起著決定性的作用。

表1 近紅外激光照射下PEG-GNR對(duì)不同菌的最低抑制濃度(MIC)Table 1Minimum inhabitation concentration(MIC) of the PEG-GNR to the different bacterium under the radiation of NIR laser

2.6 細(xì)菌壞死實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

我們對(duì)PEG-GNR介導(dǎo)的近紅外光熱殺菌機(jī)理進(jìn)行了簡(jiǎn)單的初步探索。這里使用了活死細(xì)菌染色試劑盒(LIVE/DEAD BacLight kit)對(duì)各組細(xì)菌樣品進(jìn)行染色處理，經(jīng)過(guò)染色后的死菌和活菌會(huì)在熒光顯微鏡下分別呈現(xiàn)紅色及綠色，便于我們觀察PEGGNR介導(dǎo)的近紅外光熱殺菌的情況。圖6中，A圖是空白對(duì)照組，B圖是大腸埃希氏菌與PEG-GNR溶液混合后，未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)直接用激光照射(1 W)5 min后得到的細(xì)菌樣品的熒光顯微鏡圖片，圖中呈現(xiàn)的細(xì)菌基本都為綠色，沒(méi)有出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象；C圖是菌液和PEG-GNR溶液共培養(yǎng)了2 h后但沒(méi)有使用激光照射的細(xì)菌樣品的熒光顯微鏡圖片，同樣細(xì)菌仍然基本呈現(xiàn)綠色，證實(shí)了PEG-GNR本身對(duì)細(xì)菌并沒(méi)有殺菌作用，這與圖4中所呈現(xiàn)的抑菌效果的結(jié)果是相符合的；D圖菌液和熒光顯微鏡溶液共培養(yǎng)了2 h后用激光照射(1 W)5 min后的細(xì)菌樣品的圖片，可以觀察到所有的細(xì)菌都呈現(xiàn)紅色死亡狀態(tài)，利用透射電子顯微鏡可以觀察到細(xì)菌與PEG-GNR共培養(yǎng)2 h后，細(xì)菌的細(xì)胞膜表面幾乎完全被PEG-GNR吸附(圖7)。因此，我們認(rèn)為PEGGNR介導(dǎo)的近紅外光熱殺菌的一個(gè)必要條件是細(xì)菌對(duì)PEG-GNR的有效吸附，只有當(dāng)細(xì)菌吸附或吸收了PEG-GNR后，PEG-GNR通過(guò)近紅外光的介導(dǎo)在細(xì)菌內(nèi)部產(chǎn)生高能量的熱量，才能使細(xì)胞致死。

圖6 細(xì)胞壞死情況熒光顯微鏡圖片F(xiàn)ig.6FM images of the E.coli stained with the LIVE/ DEAD BacLight kit:

圖7 細(xì)菌與PEG-GNR共培養(yǎng)2 h后細(xì)菌的電鏡照片F(xiàn)ig.7TEM image of E.coli incubated with PEG-GNR for 2 h

3 結(jié)論

采用種子生長(zhǎng)法，制備了LSPR為785 nm的金納米棒，并對(duì)其表面進(jìn)行了PEG修飾。研究表明，表面修飾PEG的金納米棒對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在近紅外照射下均有較好的抑菌效果，并且抑菌效果與金納米棒的濃度和照射功率有著密切的關(guān)系；細(xì)菌壞死實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)菌對(duì)PEG-GNR有效吸收是近紅外光熱殺菌的關(guān)鍵因素。因此，表面修飾聚乙二醇的金納米棒介導(dǎo)的近紅外光熱法能夠有效的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。由于抑菌機(jī)理與傳統(tǒng)的抗生素有著顯著的區(qū)別，近紅外光熱抑菌法的進(jìn)一步研究與發(fā)展可能會(huì)為細(xì)菌耐藥性問(wèn)題提供新的解決思路。

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Near-IR Photothermal Antibacterial Effects of Polyethylene Glycol(PEG)Modified Gold Nanorods

FENG Xiao-YanCHEN Ying＊LIU Yu-PengWANG Chun-PengCHU Fu-Xiang
(Institute of Chemical Industry of Forestry Products,CAF China;Key Laboratory of Biomass Energy and Material, Jiangsu Province China;National Engineering Laboratory for Biomass Chemical Utilization China; Key and Open Laboratory on Forest Chemical Engineering,SFA,Nanjing 210042,China)

Gold nanorods(GNR)with longitudinal surface plasma resonance(LSPR)absorption at 785 nm were synthesized by seed-mediated growth method and their surface was modified with polyethylene glycol(PEG) macromolecular(PEG-GNR).The photothermal conversion effect and cytotoxicity of PEG-GNR were investigated. Different bacteria,including gram-positive bacterium Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,gram-negative bacterium Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were used to analyze the influences of concentration of PEG-GNR and laser output power on the inhibition effects.The results show that the PEG-GNR has good antibacterial properties for both Gram positive and negative bacterium under the radiation of near-IR laser.The concentration of PEG-GNR and laser output power determined antibacterial effects of the PEG-GNR.The preliminary investigation on the antibacterial mechanism was explored by studying of bacteria apoptosis status with fluorescence microscope and transmission electronic microscope,suggesting that the effective absorption of the PEG-GNR by the cells is one of the key factors in the process of photothermal antibiosis.

gold nanorod;PEG modified;photothermal antibacterial effect

TQ131.2

A

1001-4861(2015)02-0215-07

10.11862/CJIC.2015.059

2014-04-21。收修改稿日期：2014-12-02。

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(No.CAFINT2010K04)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31100427)和江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK20131071)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：yingchencaf@gmail.com