劉麗華 杜建梅 馮寶珍

摘要：以景天三七藥材為材料，分別采用改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法對其DNA進(jìn)行提取并檢測，旨在建立一種適合中藥材景天三七的DNA提取方法。結(jié)果表明，改良CTAB法提取的DNA濃度為290 μg/mL，電泳條帶最亮，無拖尾現(xiàn)象，在濃度和純度方面均優(yōu)于其他2種方法，并可用于ISSR-CR擴(kuò)增，改良CTAB法是中藥材景天三七DNA提取的最佳方法。

關(guān)鍵詞：中藥材；景天三七；DNA提取；改良CTAB法；SDS法；高鹽低pH法

中圖分類號： S5672360文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0047-03

目前，分子生物學(xué)技術(shù)在中藥材研究中廣泛應(yīng)用，如藥用植物的親緣與進(jìn)化關(guān)系、種質(zhì)鑒定、分類和提取[-3]等，而DNA的分離純化是中藥材分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。但商品藥材經(jīng)過干燥、加工、貯藏等過程，DNA會出現(xiàn)不同程度的降解；同時，由于中藥材中的小分子次生物質(zhì)，如有機(jī)酸、萜類、香豆素、鞣質(zhì)、黃酮等含酚羥基化合物，氧化后容易與DNA結(jié)合，[2]引起DNA降解，而其中存在的多糖由于與DNA同屬于大分子化合物，在一般提取過程中很難完全去除，因此，針對不同藥材進(jìn)行DNA 提取方法的探索是有必要的。所以，本研究以市售景天三七（Sedum aizoon L）干品藥材和新鮮嫩葉為材料，采用改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法提取干品景天三七DNA，并對3種提取結(jié)果進(jìn)行比較分析，選出適合中藥材景天三七的簡便、快速、高純度的DNA提取方法，為中藥材景天三七的遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定等分子水平的研究提供依據(jù)。

材料與方法

材料

中藥材景天三七購自同仁堂藥店，嫩葉取自運(yùn)城學(xué)院栽種的中藥材景天三七。

2試劑

CTAB、SDS、V、NaCl、Tris-HCl（pH值80）、EDTA、KAc、Tris飽和酚、β-巰基乙醇、異戊醇、異丙醇購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，RNase、rimer UBC89、 Taq聚合酶等試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

3DNA提取方法

3改良CTAB法

材料加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入離心管，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液，2 μL β-巰基乙醇，充分混勻；65 ℃溫浴30～45 min，2 000 r/min 4 ℃離心0 min；上清液加入等體積酚 ∶[KG-3]三氯甲烷 ∶[KG-3]異戊醇（25 ∶[KG-3]24 ∶[KG-3]）充分混勻，2 000 r/min 4 ℃離心0 min；取上清液，重復(fù)以上步驟 ～2次，直到界面清晰為止；上清液加入等體積的三氯甲烷 ∶[KG-3]異戊醇（24 ∶[KG-3]）充分混勻，2 000 r/min 4 ℃離心0 min；上清液加入2～3倍體積的-20 ℃預(yù)冷無水乙醇，于-20 ℃靜置30 min，沉淀用70%乙醇洗2次后加入50 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃溫浴 h，4 ℃保存。

32SDS法

材料加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入離心管，加入65 ℃預(yù)熱的SDS緩沖液，2 μL β-疏基乙醇，充分混勻，65 ℃溫浴30～45 min；取出冷卻至室溫后加入500 μL 5 mol/L KAc，充分混勻，冰浴20 min，2 000 r/min離心0 min；上清液加入等體積的三氯甲烷 ∶[KG-3]異戊醇（24 ∶[KG-3]），混勻，2 000 r/min 離心0 min；重復(fù)抽提次，上清液加入2/3體積的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20 ℃沉降30 min，2 000 r/min 離心0 min；上清液加入200 μL的70%乙醇和無水乙醇各洗滌沉淀2次，沉淀晾干后加入30 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃水浴鍋中恒溫45 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

33高鹽低pH法

材料加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入離心管，加入56 ℃預(yù)熱的2% SDS緩沖液，2 μL β-巰基乙醇，充分混勻，56 ℃溫浴30 min，2 000 r/min 4 ℃離心0 min；上清液加入等體積的三氯甲烷：異戊醇（24 ∶[KG-3]），充分混勻，2 000 r/min 4 ℃離心0 min；上清液加入倍體積的異丙醇，2 000 r/min 離心5 min；沉淀的DNA用70%乙醇洗2次，晾干后加入50 μL TE，加入RNase于37 ℃溫浴 h，4 ℃保存。

4DNA質(zhì)量檢驗

4紫外檢測

將所得 DNA提取液稀釋00倍后，用UV02紫外分光光度計分別測定230 nm、260 nm及280 nm處的吸光度。根據(jù)D260 nm/D280 nm值判斷DNA純度，以D260 nm的值計算DNA濃度。

42瓊脂糖凝膠電泳檢測

將所得 DNA于%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在GelDoc2000凝膠系統(tǒng)下觀察、拍照。

43CR擴(kuò)增檢測以改良CTAB法提取的DNA為模板，用ISSR引物UBC89進(jìn)行CR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系中，含30～50 ng模板DNA，5 U Taq酶，×CR緩沖液，25 mmol/L MgCl2，4種dNTs各50 μmol/L，05 μmol/L引物，加水至25 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，GelDoc2000 凝膠成像分析系統(tǒng)拍照、分析。

2結(jié)果與分析

2紫外檢測

景天三七含有較多的糖類、鞣質(zhì)、生物堿、黃酮類等化合物，DNA提取過程中如不能很好地除去這些化合物，會導(dǎo)致分離出的DNA因結(jié)合了這些化合物而呈棕褐色，而不能用于CR擴(kuò)增、酶切等分子生物學(xué)研究。本試驗采用的上述3種方法所得DNA溶液都為淺黃色，說明這3種方法能有效地去除細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)，抑制次生代謝物與DNA結(jié)合。

采用3種方法提取的景天三七中藥全草及新鮮嫩片DNA溶液，分別用紫外分光光度計進(jìn)行純度及濃度的檢測，試驗結(jié)果見表、表2。

由表可知：改良CTAB法和高鹽低pH法提取的中藥材景天三七基因組DNA D260 nm/D280 nm值分別為75和76，純度都較高，而改良CTAB法提取的DNA濃度更高；SDS法提取的DNA純度稍低，其D260 nm/D280 nm值為72，也接近8。表明這3種方法均可以提取到純度較好的DNA，改良CTAB法提取的DNA濃度最高。

素等雜質(zhì)含量較少，DNA質(zhì)量符合分子生物學(xué)研究要求。SDS法和高鹽低pH法提取景天三七新鮮葉片基因組DNA D260 nm/D280 nm均小于8。比較3種方法提取景天三七新鮮葉片DNA的濃度，CTAB法提取DNA平均濃度為 3 μg/mL，SDS法為708 μg/mL，高鹽低pH法為 462 μg/mL。由此可見，3種方法中，CTAB法提取DNA純度最高，而SDS法提取DNA濃度最高。

22電泳檢測

采用3種方法提取的中藥材景天三七DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測所得的結(jié)果見圖。由圖可知：3種方法所提中藥材景天三七DNA完整性好，電泳條帶在溴酚藍(lán)位置均明顯發(fā)亮，說明所得DNA有較嚴(yán)重RNA污染；DNA條帶稍有拖尾，說明DNA有輕微降解，這是中藥材DNA提取中普遍存在的問題。3種提取方法中，CTAB法提取的DNA電泳條帶最整齊明亮，說明DNA完整，此結(jié)果與紫外檢測結(jié)果一致。

[FK（W2][TLLHtif][FK）]

采用3種方法提取景天三七嫩葉DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測所得結(jié)果見圖2。由圖2可知：SDS法提取DNA條帶最亮，高鹽低pH法次之，改良CTAB法提取DNA條帶較高鹽低pH法稍暗，說明3種方法中SDS法所提DNA濃度最高，高鹽低pH法次之，CTAB法最低。SDS法和高鹽低pH法提取DNA點樣孔處明顯發(fā)亮，說明該DNA樣品中可能含有未被去除的多糖、蛋白質(zhì)及一些其他次生代謝產(chǎn)物，由于這些物質(zhì)具有粘連性，易與DNA結(jié)合成復(fù)合物，致使DNA分子電泳速度比較慢，從電泳圖譜也可看出，這2種方法提取的DNA條帶電泳距離短于CTAB法提取的DNA條帶。CTAB法點樣孔處僅有微亮出現(xiàn)，說明蛋白質(zhì)、多糖雜質(zhì)去除效果較好，所提DNA較前2種方法純度高，該結(jié)果與紫外檢測結(jié)果一致。

[FK（W2][TLLH2tif][FK）]

23CTAB法提取不同材料DNA電泳分析

據(jù)以上試驗結(jié)果，可見CTAB法是景天三七藥材DNA和新鮮嫩葉DNA提取的最佳方法，并采用CTAB法提取這2種材料DNA作進(jìn)一步比較，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知：2種試驗材料所得DNA條帶在亮度上無明顯差別，新鮮嫩葉所得DNA條帶稍亮于中藥材；用新鮮葉片提取的DNA稍有降解，且在溴酚藍(lán)位置處發(fā)亮，說明嫩葉提取DNA在操作過程中更易降解，且有RNA雜質(zhì)；用中藥材提取的DNA也有輕微降解和較多的RNA污染。由該圖可以看出，采用CTAB法提取景天三七中藥材和其新鮮嫩葉DNA在得率上無明顯區(qū)別，此結(jié)果和紫外檢測結(jié)果一致，新鮮葉片提取DNA平均濃度為3 μg/mL，中藥材提取DNA平均濃度為290 μg/mL，可進(jìn)一步說明CTAB法適合景天三七中藥材和新鮮嫩葉DNA的提取。

[FK（W2][TLLH3tif][FK）]

24景天三七基因組DNA的ISSR擴(kuò)增

以改良CTAB法提取的景天三七不同材料DNA為模板，用引物UBC89進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，擴(kuò)增圖譜如圖4所示。景天三七干燥藥材和新鮮嫩葉均可擴(kuò)增出多條清晰條帶，且試驗重復(fù)性好，表明以改良CTAB法所提取的景天三七DNA質(zhì)量完全能夠滿足后續(xù)的CR擴(kuò)增反應(yīng)，可用于ISSR分子標(biāo)記。

[FK（W3][TLLH4tif][FK）]

3討論與結(jié)論

高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[4-6]，但從中藥材中獲取DNA存在較大困難。因為中藥材的加工炮制、貯藏過程都會對DNA造成一定的破壞，而且中藥材一般都儲存了較長時間，DNA存在不同程度的降解。此外，中藥材含多糖、多酚以及其他次生物質(zhì)較多，它們會和蛋白質(zhì)及核酸結(jié)合，進(jìn)而影響后續(xù)的分子生物學(xué)研究。因此，對不同中藥材DNA提取方法進(jìn)行研究很有必要。目前，在一些中藥材DNA提取中已取得了很好的效果，如柴胡[7]、玉竹[8]、貝母[9]、肉桂[0]、陳皮、牡丹皮[2]、蒲公英[3]等。

中藥材景天三七為干燥全草，含多糖、色素和多酚類物質(zhì)比較多，常規(guī)提取方法易氧化而使DNA呈褐色。本試驗在改良CTAB法提取過程中參考前人的研究結(jié)果，加入V與景天三七共同研磨，阻止多糖、多酚氧化物等與DNA結(jié)合。為了能較有效防止氧化、褐變，在提取緩沖液中加入了2% V和β-巰基乙醇。此外，對于景天三七藥材，液氮研磨比石英砂研磨能更好地破碎細(xì)胞，更有利于DNA的提取。

本研究中采取了3種方法提取景天三七藥材DNA，紫外檢測、凝膠電泳檢測及ISSR-CR擴(kuò)增表明，改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量最好，純度最高，能滿足一般分子生物學(xué)操作要求。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS][H75mm]

[ZK（#]國家藥典委員會 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑[S] 2005：25

[2]Cai Z H，Li ，Dong T X，et al Fritillaria identification method in molecular biology research harmaceutical University，2000，35（4）：309-32

[3]Cao H，Bi X，Shao Identification of Chinese drug “herbal elephantopi”by DNA fingerprinting using random primer CR Herbs，2005，20：643

[4]連曉東，譚彬，鄭先波，等 適于SSR分析的不同生長型桃幼葉基因組DNA提取方法 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，203，4（5）：30-32

[5]管長娟，梁維維，陳全家，等 高質(zhì)提取棉花總DNA的方法及引物多態(tài)性應(yīng)用 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，203，4（）：29-3

[6]陳名紅，李玉，劉多，等 利用改良CTAB法提取卷丹百合鱗葉基因組DNA 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，203，4（3）：27-29

[7]南曉潔，郝媛媛，趙艮貴，等 柴胡藥材干根DNA提取及RAD分析 中草藥，2009，40（3）：447-45

[8]陳玉秀，周日寶，潘清平，等 玉竹基因組DNA的提取與分析 西北藥學(xué)雜志，2007，22（4）：7-73

[9]王淼，譚瑩，張麗華 中藥材貝母DNA不同提取方法的比較 北華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，20，2（6）：662-665[ZK）]

[0][ZK（#]徐虹，章軍，鄭敏，等 中藥肉桂基因組DNA的提取 中藥材，2004，27（5）：326-329

嚴(yán)寒靜，高曉霞，陳曉穎 陳皮總DNA提取方法的研究 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2004，20（6）：592-593

[2]徐綱，于超，趙華 牡丹皮基因組DNA提取的影響因素研究 中國藥房，2008，9（27）：2084-2087

[3]李喜鳳，杜云鋒，張紅梅，等 蒲公英藥材總DNA的提取 河南科學(xué)，2009，27（6）：684-686