周昊 王成章 葉建中 陳虹霞 陶冉 張宇思

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，南京，210042)

銀杏(Ginkgo biloba L)又名白果、公孫樹等，為最古老的中生代孑遺植物。銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，具有改善心腦血管循環(huán)、抗過敏、抗病毒、抗癌、抗衰老及降低膽固醇等作用［1-3］。以銀杏葉總黃酮為原料的加工產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)、化妝品、食品制造業(yè)［4-5］。

銀杏葉總黃酮為熱敏性活性物，在光、熱和酶作用下容易分解，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物［6］。國內(nèi)銀杏葉提取物生產(chǎn)企業(yè)大多采用傳統(tǒng)的熱回流提取，以熱浸式和滲漉式為主，生產(chǎn)工藝存在最突出的問題是:時(shí)間長，提取效率低;對于總黃酮產(chǎn)生破壞較多;提取液質(zhì)量不高，總黃酮含量低，雜質(zhì)多，造成后續(xù)工藝提純復(fù)雜，如濃縮、醇沉、水沉、過濾、離心、吸附等，從而造成了生產(chǎn)周期長，能耗和成本大大上升，且資源浪費(fèi)嚴(yán)重［7-8］。負(fù)壓提取法通過在常規(guī)提取器上引入真空系統(tǒng)，以抽氣的形式激發(fā)的微小氣泡(空化核)在瞬間潰滅，使其周圍產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)加速原料組織中有效成分的溶出，從而實(shí)現(xiàn)了低溫、快速提取，可以有效防止提取過程中熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分解，是一種新型的提取方法［9］。負(fù)壓沸騰提取與響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)相結(jié)合在銀杏葉中總黃酮的提取中的應(yīng)用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)壓沸騰技術(shù)提取銀杏黃酮等熱敏性成分，從而為銀杏葉的提取探索一條更為有效的工藝途徑。

1 材料與方法

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀;島津SPDM20A 型二極管陣列檢測器。銀杏葉(銀杏黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9．80%)，于2012 年8 月采自邳州銀杏葉生產(chǎn)基地港上鎮(zhèn)，采集后避光自然陰干;槲皮素、山萘素、異鼠李素對照品純度均為98%以上;甲醇為色譜純;其它化學(xué)試劑均為分析純。

1．1 HPLC 測定方法

色譜條件:色譜柱C18ODS(4．6 mm×200 mm，5 μm)，流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(水)= 50 ∶50(水中含0．4%的磷酸)，檢測波長360 nm，流速1 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別精密稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素對照品適量，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0．854、0．562、0．259 g/L 的混合對照品溶液;依次精密量取混合對照品溶液0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．40 和0．50 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別取10 μL 進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。

樣品測定:精密稱取銀杏葉干粉經(jīng)提取、濃縮、干燥后制得的銀杏提取物粉末0．1 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL(V(甲醇)∶V(25%鹽酸)=4 ∶1)混合液，搖勻溶解，置于水浴(85 ℃)中加熱回流30 min，然后迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

1．2 負(fù)壓沸騰提取銀杏黃酮的單因素試驗(yàn)

提取溶劑的選擇:常壓下，分別稱取10．0 g 銀杏葉干粉原料，按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g 加入不同溶劑(水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液)，提取時(shí)間2 h，提取溫度80 ℃，測定不同提取溶劑對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

不同提取壓力對應(yīng)的沸騰溫度:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇溶液，分別采用不同的提取壓力-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05和-0．04 MPa，測定不同提取壓力下溶液開始沸騰時(shí)的溫度。

提取壓力的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g、提取時(shí)間為120 min 條件下負(fù)壓提取2 次，考察在不同提取壓力如-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05 和-0．04 MPa 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

提取時(shí)間的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 的條件下負(fù)壓提取2 次，考察在不同提取時(shí)間如15、30、45、60、90、120、150 和180 min 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

液料比的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、提取時(shí)間為60 min 的條件下負(fù)壓提取2 次，考察在不同料液比為4、6、8、10、12、15 和20 mL/g 時(shí)對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

提取次數(shù)的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g、提取時(shí)間為60 min 的條件下負(fù)壓提取，考察在不同提取次數(shù)如1、2、3、4、5 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

1．3 負(fù)壓沸騰提取銀杏黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取3 個(gè)主要試驗(yàn)因素和3 個(gè)水平，對提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，3 個(gè)主要因素為提取壓力、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和提取時(shí)間。

1．4 負(fù)壓沸騰提取與傳統(tǒng)提取的比較試驗(yàn)

分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，負(fù)壓沸騰提取工藝在優(yōu)化的最佳工藝條件下進(jìn)行;傳統(tǒng)提取工藝是按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇水溶液，80 ℃下常壓熱回流提取2 h，提取2 次，提取液過濾后合并。

2 結(jié)果與分析

2．1 銀杏黃酮的HPLC 測定結(jié)果

線性關(guān)系考察結(jié)果得出槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=28 665x-22 686，r=0．999 6，表明槲皮素在8．54 ～85．4 mg/L 質(zhì)量濃度內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系;山奈素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=30 942x+22 770，r=0．999 8，表明山奈素在5．62～56．2 mg/L 質(zhì)量濃度內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系;異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=36 469x-33 875，r=0．999 6，表明異鼠李素在2．59～25．9 mg/L 質(zhì)量濃度內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

由圖1 可知，銀杏葉總黃酮樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間基本一致，經(jīng)負(fù)壓提取得到的銀杏葉總黃酮在上述的色譜條件下，銀杏葉總黃酮的HPLC 峰分離效果較好，其峰在一定范圍內(nèi)沒有其他峰的干擾。

圖1 銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC 圖譜

2．2 單因素試驗(yàn)

提取溶劑的優(yōu)選:由表1 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總黃酮苷的提取率也隨之升高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%提取率達(dá)到最大為93．38%。但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，其提取率呈下降趨勢，其原因是銀杏黃酮易溶于含水乙醇，在一定溶液體積范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%以后，銀杏葉總黃酮溶解度最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)加大反而溶解度下降，因此，銀杏葉總黃酮的最佳提取溶劑為60%乙醇溶液。

此外，這也可能與銀杏葉的組分以及銀杏葉總黃酮的物理性質(zhì)有關(guān)，銀杏葉總黃酮易溶于乙醇水，銀杏葉總黃酮與植物組織中的蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等物質(zhì)發(fā)生復(fù)合，乙醇與水的混合液可打斷銀杏葉總黃酮物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)合鍵，有利于銀杏葉總黃酮的提取;但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會(huì)使銀杏葉中細(xì)胞失水而造成纖維間緊縮，影響銀杏葉總黃酮的滲出［10］。

不同提取壓力對應(yīng)的沸騰溫度:由于溶媒的沸點(diǎn)是隨外界大氣壓的降低而降低的，所以在負(fù)壓的條件下，就可以在較低的溫度下使溶液處于沸騰狀態(tài)下而進(jìn)行提取，這樣既不致于使植物中熱敏性物質(zhì)遭受高溫煎煮的破壞，又不會(huì)由于高溫煎煮導(dǎo)致大量容易水解產(chǎn)生大分子雜質(zhì)如淀粉、糊精、蛋白質(zhì)、色素、鞣酸、粘液質(zhì)等［11］。

試驗(yàn)測得壓力為-0．1 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為41～44 ℃;-0．09 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為46～51 ℃;-0．08 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為50 ～55 ℃;-0．07 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為60 ～65 ℃;-0．06 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為70 ～75 ℃;-0．05 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為80～85 ℃;-0．04 MPa 時(shí)對應(yīng)的沸騰溫度為86～90 ℃。

提取壓力的影響:由表1 可知，隨著提取負(fù)壓的升高，銀杏葉總黃酮的提取率先升高后降低，當(dāng)提取壓力在-0．08 MPa 時(shí)，提取率達(dá)到最大。其原因可能是提取負(fù)壓的上升，使得提取溫度降低，銀杏葉總黃酮在溶液中擴(kuò)散速度變慢，提取率會(huì)有所降低。故提取壓力優(yōu)選為-0．08 MPa。

提取時(shí)間的影響:由表1 可知，隨著提取時(shí)間的增加，銀杏葉總黃酮的提取率呈上升趨勢，60 min 時(shí)達(dá)到最大值;隨著時(shí)間的延長提取率會(huì)略有下降，這表明銀杏葉總黃酮的溶出量與時(shí)間密切相關(guān)，提取時(shí)間過短可能使提取不夠充分，但提取時(shí)間過長又可能引起銀杏葉總黃酮結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使其含量降低。

料液比對提取率的影響:由表1 可知，隨著乙醇溶液體積量的增加，銀杏葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，在V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g的條件下銀杏葉總黃酮的提取率達(dá)到93．26%，繼續(xù)增加料液比其提取率變化不大;其原因可能是隨著料液量增加，銀杏葉總黃酮溶解量增加，使其提取率升高;但是銀杏葉總黃酮在水的體積量較大的情況下容易水解，并且隨著溶液總體積量增大，水的體積量也相應(yīng)的增加最終使銀杏葉總黃酮水解程度加劇，從而影響銀杏葉總黃酮提取率。因此，最優(yōu)選擇為V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g。

提取次數(shù)的影響:銀杏葉總黃酮在負(fù)壓提取的條件下，提取1 次，提取率為73．34%，提取2 次，提取率達(dá)到96．79%。2 次提取幾乎把銀杏葉總黃酮提取完全。因此在負(fù)壓提取條件下，從生產(chǎn)成本及可操作性等方面綜合考慮選擇2 次提取較為合適。

表1 銀杏葉總黃酮負(fù)壓提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2．3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化

2．3．1 回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

利用Design-expert7．1．6，采用Box-Behnken 模型以銀杏總黃酮提取率為指標(biāo)，選取提取壓力(A)、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)(B)、提取時(shí)間(C)設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 個(gè)試驗(yàn)，其中包括13 個(gè)析因試驗(yàn)和4 個(gè)檢驗(yàn)誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

通過對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=92．93+2．22A+0．18B+1．55C-1．13AB-1．14AC+1．57BC-3．56A2-2．93B2-1．57C2。從表3 可以看出，模型的F＜0．000 1，表明該模型非常顯著;信噪比=16．697，說明該模型可用于預(yù)測;修正可決系數(shù)=94．92%，表明總變異中僅有5．08%不能用該模型解釋;可決系數(shù)=97．78%，表明銀杏葉總黃酮提取率的預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度。失擬項(xiàng)的F 值為0．053，系統(tǒng)顯示為不顯著。也說明使用該方程進(jìn)行擬合的效果較好，因此該模型可用于分析、預(yù)測銀杏葉總黃酮的實(shí)際提取率。

表2 銀杏葉總黃酮負(fù)壓提取工藝的響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

另外從表3 還可以看出，一次項(xiàng)中A 和C 的回歸系數(shù)極顯著，說明提取壓力和時(shí)間對銀杏葉總黃酮提取率有極顯著影響;而B 的回歸系數(shù)不顯著，即V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)對響應(yīng)值沒有顯著影響。交互項(xiàng)AB 和AC 的偏回歸系數(shù)顯著，即提取壓力和V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)、提取壓力和時(shí)間的交互項(xiàng)對銀杏葉總黃酮提取率有顯著影響。交互項(xiàng)BC 的偏回歸系數(shù)極顯著，說明V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和時(shí)間的交互項(xiàng)對銀杏葉總黃酮提取率有極顯著影響;二次項(xiàng)中A2、B2、C2的偏回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平。

表3 回歸模型方差分析

2．3．2 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取壓力、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和提取時(shí)間對銀杏葉總黃酮提取率的影響，如圖2 所示。等高線的形狀可反應(yīng)交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖3 中可以看出，各因素間的交互作用顯著。響應(yīng)曲面可較為直觀地看出各因素對銀杏葉總黃酮提取率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對提取率的影響越大，由圖2 可以看出，提取壓力和提取時(shí)間對銀杏葉總黃酮提取率的影響最顯著，表現(xiàn)為在各圖中曲面較陡，而V(60%乙醇):m(銀杏葉干粉)的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線較平滑，這也符合表3 的方差分析結(jié)果。

圖2 各因素之間的響應(yīng)曲面及等高線圖

2．3．3 最佳提取工藝的確定及模型的驗(yàn)證

由分析軟件可直接得出最優(yōu)提取工藝為:提取壓力-0．082 18 MPa，提取時(shí)間74．13 min，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 11．16 mL ∶1 g，所得銀杏葉總黃酮提取率為93．55%，但從試驗(yàn)的可行性考慮，將最優(yōu)工藝調(diào)整為:提取壓力-0．08 MPa，提取時(shí)間70 min，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，并結(jié)合實(shí)際提取銀杏黃酮，重復(fù)試驗(yàn)3 次，所得的銀杏葉總黃酮提取率分別為93．06，93．48 和93．72，平均值為93．42%，二者的誤差小于0．5%。說明由響應(yīng)面法所得的銀杏葉總黃酮提取條件與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果相近，有很好的參考作用。

2．4 銀杏黃酮的負(fù)壓沸騰提取與傳統(tǒng)提取工藝的比較

以銀杏葉總黃酮提取率和干膏的得率為考察因素，對銀杏葉總黃酮的負(fù)壓沸騰提取工藝與傳統(tǒng)的常壓回流提取工藝進(jìn)行了比較，結(jié)果見表4，結(jié)果表明負(fù)壓沸騰提取法的提取率要高于傳統(tǒng)的常壓回流提取法，且負(fù)壓沸騰提取工藝所得的干膏質(zhì)量小，雜質(zhì)含量減少，負(fù)壓提取時(shí)間也較短，較常壓提取時(shí)間減少了42%，大大降低生產(chǎn)成本。

表4 負(fù)壓與常壓回流提取法比較

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用RSA 優(yōu)化了銀杏黃酮的負(fù)壓沸騰提取工藝參數(shù)，建立了回歸模型方程，該模型回歸極顯著，說明該方程對試驗(yàn)擬合較好。通過響應(yīng)面分析得到優(yōu)化的提取工藝條件是:以60%乙醇溶液為提取溶劑，提取壓力-0．08 MPa，提取時(shí)間70 min，提取溫度50 ℃，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g，提取2 次。該條件下銀杏葉總黃酮提取率的預(yù)測值為93．55%，驗(yàn)證值為93．42%，兩者十分接近，說明響應(yīng)值的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，優(yōu)化結(jié)果可信，具有實(shí)用價(jià)值。

與傳統(tǒng)的高溫?zé)峄亓魈崛》椒ㄏ啾?，采用?fù)壓沸騰法提取銀杏葉中總黃酮，不僅提取溫度低為50 ℃，保證銀杏黃酮等熱敏性成分不被破壞，且提取時(shí)間大大縮短了42%，提取率大大提高了13%，提取液中黃酮含量提高了65．90%，明顯好于傳統(tǒng)方法，優(yōu)勢明顯。因此該方法可為工業(yè)化提取銀杏黃酮提供借鑒。

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