朱 蕓，連 石，張海萍，朱 威

梅毒是一種慢性、全身性性傳播疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可累及全身多個(gè)器官系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人類健康[1]。我國(guó)的梅毒發(fā)病率仍然在各類性傳播疾病中居于首位。據(jù)《中國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃（2010—2020）》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部）統(tǒng)計(jì)，2009年全國(guó)新發(fā)病例達(dá)10 757例， 上一年增長(zhǎng)49.2%，且繼續(xù)呈上升趨勢(shì)[2]。由于其病原體——梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）的體外培養(yǎng)困難，至今尚未獲得成功，故限制了相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，近年來(lái)關(guān)于TP的研究不斷涌現(xiàn)出新的熱點(diǎn)，本文就相關(guān)的免疫學(xué)內(nèi)容綜述如下。

1 TP的主要膜脂蛋白

以往研究認(rèn)為，TP的部分膜脂蛋白具有免疫原性，在激活炎癥細(xì)胞、誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)等方面具有重大作用。Fraser等于1998年完成了TP DNA的全基因組測(cè)序，他們測(cè)定出TP全長(zhǎng)為1 138 006 bp，含有1 041個(gè)開放閱讀框架（opening reading frames，ORF），并推測(cè)TP可能具有22種外膜脂蛋白[3]。McKevitt等認(rèn)為這些脂蛋白中至少有12種與TP的致病性密切相關(guān)，完整膜脂蛋白的缺乏可能是造成TP免疫逃避的機(jī)制之一[4]。

在TP的眾多膜脂蛋白中，目前研究較多的有TpN47(Tp0574)、TpN17(Tp0435)、TpN15(Tp0171)以及TmpA(Tp0768)，這些脂蛋白具有強(qiáng)大的前炎癥活性，與TP引起的梅毒免疫反應(yīng)密切相關(guān)[5,6]，其組合抗原已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)TP的試劑盒中[7]。此外，近年來(lái)研究較多的蛋白還有Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)，以及Tp0655、Tp0993等。

Wesley等于2003年應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件篩選的辦法推測(cè)出若干種可能的TP膜脂蛋白，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)重組蛋白的敏感性和特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)均為可能的TP膜脂蛋白，其中Tp0453的敏感性和特異性最高（100%），后兩者的敏感性、特異性分別為98%、97%以及91%、93%，并認(rèn)為此3種蛋白能夠單獨(dú)或混合用于梅毒的血清學(xué)診斷[8]。Tp0453長(zhǎng)864 bp，編碼287個(gè)氨基酸，分子量約為31 900。Hazlett等[9]認(rèn)為Tp0453是一種特殊的膜蛋白，其結(jié)構(gòu)域中富含α-螺旋而缺乏β-折疊，前者嵌入TP膜脂質(zhì)雙分子層中，但不暴露于TP表面，無(wú)法被免疫系統(tǒng)識(shí)別，這是TP逃避宿主免疫反應(yīng)的可能機(jī)制之一。此外，Hazlett等[9]證實(shí)Tp0453能夠促進(jìn)某種marker的經(jīng)膜釋放，這提示其可能與TP營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝密切相關(guān)。Liu等[10]利用基因工程技術(shù)成功制備出Tp0453重組蛋白，并用其免疫新西蘭家兔，證明具有良好的免疫原性；蛋白印跡法(Western-blot)和ELISA方法使其與患者血清反應(yīng)，證明具有良好的免疫反應(yīng)性。

Tp0655全長(zhǎng)1 047 bp，編碼348個(gè)氨基酸。細(xì)菌中的膜脂蛋白往往具有參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，參與酶促反應(yīng)，激活機(jī)體免疫應(yīng)答等多方面的作用。Machius等[11]應(yīng)用基因工程技術(shù)制備rTp0655，X線衍射技術(shù)測(cè)定其晶體結(jié)構(gòu)，并驗(yàn)證功能。結(jié)果證實(shí)Tp0655為TP的膜脂蛋白，其結(jié)構(gòu)與E.coli的PotD具有同源性，是ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠優(yōu)先與腐胺特異性結(jié)合，其次與亞精胺結(jié)合，后兩者在維持細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和死亡過(guò)程中具有重要作用。此外，由于TP缺乏鳥氨酸、精氨酸脫羧酶[2,12]，故Tp0655可能在細(xì)胞代謝過(guò)程中承擔(dān)著較為重要的作用。多胺在體液中濃度較低，而在宿主細(xì)胞內(nèi)濃度較高，Machius等[11]據(jù)此推測(cè)TP可能在發(fā)病過(guò)程中的某一階段侵入人體細(xì)胞中獲取代謝原料，這與傳統(tǒng)上TP不侵入細(xì)胞內(nèi)的觀念有所差異，具體情況有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

Tp0993全長(zhǎng)957 bp，編碼318個(gè)氨基酸，分子量約為33 300。McKevitt等[13]于2005年利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)了882種TP蛋白，并將其與TP感染后的新西蘭兔血清反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其中106種蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，包括22種已知蛋白和84種未知蛋白。Tp0993在此次實(shí)驗(yàn)中首次被發(fā)現(xiàn)，并能夠與TP感染新西蘭兔后各個(gè)時(shí)期（第14天，28天，56天和84天）的血清產(chǎn)生免疫反應(yīng)。McKevitt等認(rèn)為Tp0993是一種含量較低的TP脂蛋白，推測(cè)其可能位于TP外膜上，這可能與其較好的免疫性相關(guān)。Brinkman等[14]于2006年用類似方法獲得908種TP重組蛋白，以梅毒患者血清代替新西蘭兔血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Tp0993能與各期患者血清發(fā)生良好的免疫反應(yīng)（潛伏梅毒，早期、晚期梅毒），并且與正常對(duì)照組血清不反應(yīng)，這提示Tp0993可以作為潛在抗原，對(duì)各期梅毒具有診斷價(jià)值。我國(guó)謝小平等[15]以Tp0993重組蛋白為抗原建立ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)480例臨床血清進(jìn)行分析，證實(shí)其靈敏度及特異性均較高，可作為梅毒診斷的候選抗原之一。

2 TPrK蛋白

TprK是一種特殊的TP膜蛋白，屬于TprP重復(fù)蛋白家族的12種蛋白(TprA~L)之一，后者又可分為Ⅰ(TprC、D、F、I)、Ⅱ(TprE、G、J)、Ⅲ(TprA、B、H、K、L)3個(gè)亞家族。近年來(lái)研究認(rèn)為TprK蛋白既能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，又是梅毒螺旋體發(fā)生免疫逃避的重要原因之一，故單獨(dú)綜述如下。

Centurion等[16]較早對(duì)TprK蛋白進(jìn)行了報(bào)道，他們通過(guò)對(duì)TprK基因的ORF進(jìn)行DNA測(cè)序，推測(cè)其包括若干個(gè)含有高度保守序列的恒定區(qū)及7個(gè)可變區(qū)（V區(qū)），可變區(qū)序列與TprP的Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)亞家族缺乏同源性，可能具有較強(qiáng)的免疫特異性。LaFond等[17]對(duì)TprK蛋白V區(qū)的可變性進(jìn)行了研究，他們用3種不同的TP菌株感染新西蘭兔，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Chicago A株感染后獲得的血清對(duì)可變區(qū)V5、6、7產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，經(jīng)Chicago B株感染后對(duì)V2、V4～7產(chǎn)生應(yīng)答，而經(jīng)Chicago C株感染后則對(duì)V2～7產(chǎn)生應(yīng)答，且各型菌株與血清之間幾乎不存在交叉反應(yīng)。TprK基因的高度可變性可能在TP逃避宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，這是導(dǎo)致梅毒感染慢性化的可能機(jī)制之一。

TprK蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[16]。Morgan等[18]用TprK蛋白片段免疫新西蘭兔，并使其再次接觸同菌株TP后，發(fā)現(xiàn)家兔體內(nèi)的脾細(xì)胞出現(xiàn)增生反應(yīng)，且兔血清能夠?qū)prK蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中，TprK的恒定區(qū)具有T淋巴細(xì)胞識(shí)別表位，而V區(qū)則具有B淋巴細(xì)胞識(shí)別表位。同時(shí)，家兔體表潰瘍出現(xiàn)更晚，且潰瘍的面積和數(shù)量均小于正常對(duì)照組，這提示TprK誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生的免疫反應(yīng)具有保護(hù)性。Giacani等[19]對(duì)4種不同TP菌株免疫新西蘭兔后Tpr基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定，并測(cè)定了不同感染時(shí)期T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TprK基因的表達(dá)在4種菌株中均高于其他基因，但低于作為參照的47-KDa脂蛋白基因。各菌株免疫的家兔表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性，亞家族Ⅰ中的TprC、D能誘導(dǎo)家兔脾細(xì)胞增生，而TprK誘導(dǎo)的這一反應(yīng)更為強(qiáng)烈。此外，T淋巴細(xì)胞對(duì)于TprK蛋白的反應(yīng)性在各個(gè)時(shí)期的家兔中均維持在較高水平，這提示TprK基因可能在長(zhǎng)期感染過(guò)程中一直處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。

抗原變異是病原體逃避宿主免疫、引起感染慢性化的常見機(jī)制。免疫壓力(immune pressure)屬于生物進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力(selective pressure）的一種，是病原體變異的主要?jiǎng)恿χ?。最近，Giacani等[20]對(duì)免疫壓力作用下TP的抗原變異狀況及其原因進(jìn)行了研究。他們將TP感染后的新西蘭兔分為免疫活性組和免疫抑制組（注射甲潑尼龍），6周后進(jìn)行抗體檢測(cè)、基因測(cè)序及mRNA測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫抑制組家兔的抗體產(chǎn)生時(shí)間晚、數(shù)量少，局部皮損的數(shù)目更多、面積更大。抑制組與對(duì)照組家兔的TprK基因V4~V7區(qū)分別于感染后第5、5、3、4周出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后者表現(xiàn)出更強(qiáng)的變異性。值得注意的是，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，V6區(qū)基因多樣性的增加與抗-V6抗體數(shù)目的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出平行關(guān)系，這提示特異性抗-V6抗體在TprK的基因選擇及其導(dǎo)致的TP抗原變異種中可能起到一定作用。

3 應(yīng)用

梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是診斷梅毒的重要手段之一，目前國(guó)內(nèi)外均已有多種商業(yè)化的成品試劑盒，但仍不能用于各期梅毒的檢測(cè)[7,21]。對(duì)于TP的免疫學(xué)研究，有助于為各期梅毒提供全面、有效的診斷方法，并使梅毒疫苗的研制成為可能。

目前常用的梅毒檢測(cè)方法是將TP重組膜蛋白Tp47、Tp15、Tp17、TmpA、Tp37中的2種以上作為混合抗原，應(yīng)用ELISA、Western-blot、免疫層析法(ICA)等方法，通過(guò)檢測(cè)血清中的TP特異性抗體，達(dá)到診斷梅毒的目的[22]。這些檢測(cè)方法存在生物學(xué)假陽(yáng)性、假陰性的可能，且對(duì)于TP感染早期、免疫功能低下患者以及晚期梅毒患者診斷效果不佳。隨著計(jì)算機(jī)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們一方面利用生物信息學(xué)軟件分析、尋找其他具有潛在診斷價(jià)值的TP蛋白，另一方面通過(guò)基因重組技術(shù)獲得大量蛋白，隨后再驗(yàn)證其免疫原性及免疫反應(yīng)性。目前的研究熱點(diǎn)除上文提到的Tp0453、Tp92、Gpd、Tp0993等外，還有Tp0136、Tp0751、Tp0319[23-25]等重組蛋白。這些蛋白能夠與Tp47等蛋白聯(lián)合應(yīng)用，作為混合抗原應(yīng)用于梅毒的診斷。雖然目前關(guān)于這些蛋白的研究大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，但其未來(lái)的應(yīng)用前景仍然值得期待。

梅毒與HIV共感染的現(xiàn)象近年來(lái)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。梅毒引起的生殖器潰瘍促進(jìn)了HIV的傳播，其造成的短暫免疫功能異常又有可能引起HIV病毒載量的增加和CD4細(xì)胞數(shù)的下降[26,27]，因此，梅毒疫苗的研究具有切實(shí)的臨床意義和價(jià)值。由于TP無(wú)法在體外進(jìn)行培養(yǎng)，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、不便于操作，故其重組亞單位疫苗的研制是目前主要的研究方向。梅毒發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制復(fù)雜，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅證實(shí)Tp19、Tp36、Gpd等具有部分保護(hù)作用[28]，國(guó)內(nèi)外尚未研制出具有完全保護(hù)作用的疫苗[29]。上文中提到的TprK蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，且能夠在TP感染后持續(xù)存在，可作為TP疫苗的候選抗原，但具體應(yīng)用價(jià)值有待于進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

梅毒是性病中危害較大的疾病，目前關(guān)于其致病機(jī)制、免疫應(yīng)答等問題尚未完全明確，其診斷、治療及疫苗等課題有待進(jìn)一步研究。隨著基因工程、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，TP的免疫學(xué)研究必將進(jìn)一步深入和細(xì)化，從而帶動(dòng)梅毒領(lǐng)域的全方位研究，達(dá)到促進(jìn)人類健康的最終目的。

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