王嬌，張筠，*，劉術明，劉文麗

（1.黑龍江東方學院，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司黑龍江安達151400）

乳和乳制品中嗜冷菌及其耐熱酶的危害與控制研究

王嬌1，張筠1，*，劉術明2，劉文麗2

（1.黑龍江東方學院，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司黑龍江安達151400）

嗜冷菌是乳低溫貯藏中的主要腐敗菌，嗜冷菌及其代謝酶的存在直接影響原料乳的質(zhì)量，闡述了嗜冷菌及其耐熱酶類對乳及乳制品的危害，并通過分析嗜冷菌的適冷機理和影響酶活的因素，探討控制嗜冷菌及其代謝酶的方法，以保障原料乳質(zhì)量。

嗜冷菌；耐熱酶；危害；控制方法

嗜冷菌（Psychrotrophic bacteria）是指在6.5℃條件下，需氧培養(yǎng)10 d，在MPC瓊脂平板上形成可計數(shù)菌落的細菌、酵母和霉菌，嗜冷菌包含有假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿菌屬，黃桿菌屬和克雷伯氏菌屬等［1］，由于生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大，原料奶需要在工廠貯存的時間隨之變長，低溫貯藏時嗜冷菌大量生長繁殖，因為大多數(shù)嗜冷菌經(jīng)巴氏殺菌即可被殺死而往往被忽略，近年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)嗜冷菌在低溫條件下分泌的胞外蛋白酶、脂肪酶即使經(jīng)高溫處理仍能保留一部分活性，在低溫貯藏時酶的活性逐漸被激活，它能分解乳制品中的脂肪和蛋白質(zhì)，導致產(chǎn)品凝結、分層、產(chǎn)生苦味等不良品質(zhì)。

1　嗜冷菌及其耐熱酶對乳及乳制品的危害

1.1對原料乳的危害

低溫貯藏時，原料乳中的嗜冷菌大量生長繁殖，嗜冷菌的繁殖過程中會代謝產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，這些酶會導致乳中脂肪和蛋白質(zhì)的分解。張甦［2］研究證明在4℃下貯存44 h～48 h時嗜冷菌數(shù)量最多并發(fā)生明顯質(zhì)變，如乳清析出、蛋白凝結和不良氣味的產(chǎn)生，此外，王輝［3］、任靜［4］、岳喜慶［5］等分析了酶活力與嗜冷菌數(shù)之間的關系，認為菌數(shù)與酶活力呈正相關，并證明菌體生長進入穩(wěn)定期后，酶活即穩(wěn)步增長，原料乳的質(zhì)量也隨之下降。

1.2對乳制品的危害

關于嗜冷菌代謝產(chǎn)生酶對乳制品質(zhì)量的影響目前研究較多集中在其對UHT乳質(zhì)量方面，Patricia Munsch-Alatossava［6］等研究證明，嗜冷菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶會分解UHT乳中的脂肪球膜釋放游離脂肪酸，導致脂肪上浮，pH值逐漸下降，蛋白酶能分解乳蛋白導致產(chǎn)品發(fā)苦并引起黏度的變化而形成膠凝，口感風味變差，貨架期變短，張書文［7］、趙澤民［8］等研究證明，嗜冷菌產(chǎn)生的酶可導致UHT乳色澤的改變以及焦糖化反應加劇。姚春燕［9］提出嗜冷菌可導致干酪產(chǎn)量下降且呈現(xiàn)軟而粘稠的組織結構，表面出現(xiàn)斑點、產(chǎn)生腐爛及腐敗氣味等，用接種了嗜冷菌的原料乳制作酸奶，結果酸奶的風味很差。此外，奶粉的結塊、發(fā)苦等不良品質(zhì)也被認為與嗜冷菌有關。

2　嗜冷菌產(chǎn)生的酶

2.1蛋白酶

嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶可分為三類：胞內(nèi)蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶，菌體被殺死后，胞內(nèi)蛋白酶釋放到乳中影響產(chǎn)品的品質(zhì)，早在1984年，Kough［10］等就證明UHT奶發(fā)生膠凝與嗜冷菌產(chǎn)生的胞內(nèi)蛋白酶有關，但目前研究較多的是胞外蛋白酶，主要是假單胞菌屬產(chǎn)生的耐熱的堿性金屬蛋白酶，Zn2+和Ca2+構成酶活中心，分子量40 kD～50 kD，一般出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，最適溫度和pH分別為30℃～40℃和6～8，它能優(yōu)先水解к-酪蛋白，使其失去對酪蛋白膠束的穩(wěn)定作用，從而導致產(chǎn)品凝乳、分層等。

國外對嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶的耐熱性研究較早，1981年，Griffiths［11］等就通過研究13株假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶的熱穩(wěn)定性后得知這些蛋白酶經(jīng)77℃，15 s的熱處理仍然可保留55%～65%的活性，140℃加熱5 s后仍能保留20%～40%的活性，而Adams［12］的研究也表明熒光假單胞菌MC60產(chǎn)生的蛋白酶在149℃的耐熱能力是嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的4 000倍，均證明該蛋白酶對熱有極高的穩(wěn)定性。

2.2脂肪酶

部分嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶極其耐熱，殘留的脂肪酶能分解脂肪釋放的游離脂肪，這些游離脂肪在脂肪球的相互碰撞中起到粘合劑的作用，從而產(chǎn)生脂肪球簇而上浮，導致乳質(zhì)量的變化［13］，假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶最適pH 8～9，多數(shù)在常乳中具有相當大的活性，最適反應溫度為30℃～50℃，但有些在1℃～8℃，甚至更低的-10℃～-30℃也能引起乳制品腐敗變質(zhì)，因此控制脂肪酶的產(chǎn)生至關重要。

2.3半乳糖苷酶

除蛋白酶和脂肪酶外，嗜冷菌還能產(chǎn)生部分半乳糖苷酶，半乳糖苷酶能水解含半乳糖苷鍵的物質(zhì)，如乳糖等，引起乳品質(zhì)的變化。半乳糖苷酶與蛋白酶和脂肪酶一樣，含有其他嗜溫酶類不具有的氨基酸殘基，可提高酶的耐熱性。

3　控制嗜冷菌及其酶活性的方法

3.1酶耐熱和嗜冷菌的適冷機理

目前，對嗜冷菌代謝產(chǎn)生的酶的耐熱原因的研究相對較少，楠丁呼思勤［14］等在總結中外研究的基礎上認為這些酶的耐熱特性可能與其特殊的化學結構如氨基酸組成、蛋白質(zhì)結構、氫鍵、共價鍵等有關，但其精確的耐高溫機理還不清楚。嗜冷菌的適冷代謝機理方面，李晶等［15］認為，嗜冷菌之所以能保持在低溫環(huán)境下的生長代謝，與其特殊的細胞結構有關，可支持其在在低溫下吸收營養(yǎng)物質(zhì)、正常產(chǎn)酶并保持酶的高活性。

3.2嗜冷菌及其代謝酶活的測定

3.2.1嗜冷菌的檢測

目前對于嗜冷菌計數(shù)的方法較多，傳統(tǒng)方法采用IDF推薦的PMC瓊脂平板在6.5℃培養(yǎng)10 d之后計數(shù)，這種方法相對準確，成本較低，但培養(yǎng)時間長，不利于工廠的實際應用，IDF同時提出了嗜冷菌的快速檢測方法：21℃培養(yǎng)25 h，但其結果只是估計值，不夠準確，且該方法并未進行特異性篩選，21℃中存在嗜溫菌生長的可能性，使檢測結果不穩(wěn)定；Maurilio［16］對apr基因設計簡并引物，并利用PCR技術擴增假單胞菌屬的apr基因，可以檢測105cfu/mL的復原脫脂乳中的擴增產(chǎn)物，關晶巖［17］在此基礎上確立了DNA提取的最佳方法并建立了兩種基于PCR和熒光定量技術的原料乳中嗜冷菌計數(shù)的方法：16SrRNA-PCR計數(shù)法和apr-PCR計數(shù)法；Solimar Gon?alves Machado［18］等提出用PCR技術來檢測原料乳中嗜冷菌，Danilo Ercolini［19］等采用隨機擴增多態(tài)性DNA-PCR技術對原料乳中的嗜冷菌進行分子鑒定，李琳等［20］在研究各種快速檢測方法的基礎上分別分析了直接外熒光過濾（DEFT）、流式細胞計數(shù)（FCM）、實時PCR檢測（RTPCR）、熒光原位雜交探針（FISH）、瞬時溫度梯度凝膠電泳（TTGE）、ATP生物發(fā)光等技術的優(yōu)缺點，為實際應用提供參考。

除了直接對嗜冷菌進行檢測，Uelinton Manoel Pinto［21］等通過檢測革蘭氏陰性嗜冷菌中高絲氨酸內(nèi)酯的量來間接反應嗜冷菌的量。

3.2.2嗜冷菌代謝酶活性的檢測

根據(jù)酶活力的定義，可通過測定底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來測定酶的活力，一般測定嗜冷菌蛋白酶的方法有福林-酚、瓊脂擴散、茚三酮、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）等。近兩年又開始運用RP-HPLC和熒光胺方法，但這些方法在使用上都存在局限性，王輝［22］等提出了用Azocasein法測定嗜冷菌耐熱胞外蛋白酶活性的方法，并得出波長345 nm，酶與底物反應時間2 h，TCA質(zhì)量分數(shù)12%，TCA終止反應后溶液靜置時間30 min為最佳反應條件，該方法檢出限好，操作簡單，是檢測乳中嗜冷菌代謝蛋白酶活性的理想方法。脂肪酶活性的測定方法較多，針對乳中嗜冷菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶的測定，王歡等［23］比較了羅丹明平板法、橄欖油乳化法、對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活和對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活4種常用的脂肪酶活力測定方法，認為對硝基苯酚法重現(xiàn)性好，適用于脂肪酶活力的定量檢測。

3.3控制措施

有研究證明［7］，4℃下儲存的原料奶，如果初始嗜冷菌數(shù)小于5×104cfu/mL，則儲存4 d后，嗜冷菌數(shù)小于1×105cfu/mL，若大于5×104cfu/mL，則4 d后嗜冷菌數(shù)大于5×105cfu/mL，由此可見，低溫的抑制效果取決于原奶中嗜冷菌的初始含量，所以，控制原奶中嗜冷菌的數(shù)量顯得尤為重要，牧場的環(huán)境衛(wèi)生是控制乳中嗜冷菌數(shù)量的關鍵環(huán)節(jié)，牧場牛舍空氣，草屑，牛糞等均藏有大量的嗜冷菌［24］，因此擠奶前對牧場環(huán)境和牛體衛(wèi)生的處理非常必要；而相同的原料奶在2℃儲存比在4℃儲存生產(chǎn)出的UHT乳保質(zhì)期更長，可采用深度冷藏的方法減少嗜冷菌及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；郭奇慧等［25］通過實驗證明UHT乳中纖維蛋白酶活力、蛋白沉淀量、下層蛋白粒徑、游離氨基氮含量隨貯存時間的延長而增加，同時，4℃下嗜冷菌的平均代時一般為8 h～9 h［9］，縮貯存時間也是控制嗜冷菌產(chǎn)生酶的有效方法。

劉美鳳［26］研究了加壓CO2對熒光假單胞菌的殺菌效果，證明加壓CO2可以延長細菌的延遲期，姚春艷［9］研究了CO2對延長農(nóng)家干酪保質(zhì)期的作用，證明其對假單胞菌屬、腸桿菌屬和乳酸菌均有一定的抑制作用，岳喜慶，李鵬［27］研究了乳酸鏈球菌素和EDTA對原料乳保鮮的作用，認為其能延長原料乳的保藏時間，王蕊等［28］、劉芳等［29］、喻東威等［30］分別研究了超聲波、殼寡糖對原料乳保鮮的作用，認為它們均能在一定程度上抑制原料乳中嗜冷菌的生長，Mahmoud Sitohy［31］等研究證明在4℃下水牛乳中加入0.5%酯化大豆蛋白能顯著抑制嗜冷菌的生長、產(chǎn)酸能力和蛋白分解能力，添加酯化大豆蛋白后酪蛋白的分解時間由2 d延長為10 d。Patricia Munsch-Alatossava［6，32］等等研究了N2對原料乳中嗜冷菌及其代謝酶的抑制作用，證明在6、7、12℃均能有效抑制乳中嗜冷菌的生長，延長乳的保藏時間。

酶活性方面，溫度和pH是影響酶活的關鍵因素，多數(shù)嗜冷菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶的最適溫度和pH為30℃～40℃和6～8，脂肪酶的最適溫度和pH分別為30℃～50℃和8～9。其中pH對其影響更大，適當調(diào)節(jié)可以部分抑制酶活性，但不能使之完全失活，對企業(yè)來說，最有效的方法還是從源頭控制嗜冷菌的數(shù)量，并減少其代謝酶的產(chǎn)生。

4　結論與討論

嗜冷菌代謝產(chǎn)生的酶對乳及乳制品的品質(zhì)有很大的影響，目前的研究多集中在對嗜冷菌及其代謝酶的檢測方面，對嗜冷菌的控制也多為理論研究，如添加抑菌物質(zhì)等，較少能應用于實際生產(chǎn)，對乳品企業(yè)來說，做好源頭控制，減少嗜冷菌的帶入是最直接的控制措施，同時做好深度冷藏，減少貯藏時間，以減少耐熱酶的產(chǎn)生，對乳制品的品質(zhì)至關重要。

研究證明嗜冷菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶對乳及乳制品的品質(zhì)有較大的影響，因此，所以加強對蛋白酶和脂肪酶特性的研究比單純研究嗜冷菌本身更有意義。

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Hazard Analysis and Control of Psychrotrophic Bacterias and Heat Resistant Enzymes in Raw Milk and Dairy Products

WANG Jiao1，ZHANG Yun1，*，LIU Shu-ming2，LIU Wen-li2
（1.East university of Heilongjiang，Haerbin 150086，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Beingmate Dairy Co.，Ltd.，Anda 151400，Heilongjiang，China）

Psychrotrophic bacteria is the primary putrefying bacteria in low-temperature storage raw milk，Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made have enormous implications on raw milk，in this article，the perniciousness Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made to milk and dairy products are introduced，by analyze the mechanism how Psychrotrophic bacteria can live in low temperature and the factors that influence the enzymes'activities，investigate the methods to control Psychrotrophic bacteria and the enzymes they produce to guarantee the quality of raw milk.

Psychrotrophic bacteria；thermostable enzymes；perniciousness；control methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.038

2014-03-04

王嬌（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：乳品質(zhì)量安全。