馬 勇，張桂銘，孫立江

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，山東青島 266021)

·基礎(chǔ)研究·

大黃素增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

馬 勇，張桂銘，孫立江

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，山東青島 266021)

目的 探討大黃素增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的化療作用及其機(jī)制。方法 建立膀胱癌T24細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型，將荷瘤鼠隨機(jī)分為：Con組(生理鹽水)、Cis組(順鉑50 mg/kg)、Emo組(大黃素40 mg/kg)和Cis+Emo組(聯(lián)合用藥，順鉑50 mg/kg+大黃素40 mg/kg)。腹腔注射給藥，每3 d 1次，共8次。給藥后測(cè)量腫瘤體積及質(zhì)量。采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(Tunel)檢測(cè)各組標(biāo)本腫瘤細(xì)胞凋亡情況。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、凋亡抑制因子(XIAP)和胱天蛋白酶(Caspase-3)蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)NF-κB、XIAP和Caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 Cis+Emo組腫瘤體積和質(zhì)量明顯小于其他各組。Tunel實(shí)驗(yàn)顯示，Cis+Emo組細(xì)胞凋亡水平明顯高于其他各組。免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示：與Con組相比較， Emo組和Cis+Emo組的NF-κB、XIAP蛋白、mRNA的表達(dá)顯著下降；與Cis組和Emo組相比較，Cis+Emo組的NF-κB、XIAP蛋白、mRNA的表達(dá)顯著下降；與其他各組相比，Cis+Emo組的Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)。結(jié)論 大黃素可以通過(guò)下調(diào)NF-κB和XIAP、上調(diào)Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤誘導(dǎo)凋亡作用。

大黃素；順鉑；膀胱癌；化療耐藥；NF-κB；XIAP；Caspase-3；細(xì)胞凋亡

膀胱癌是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。全國(guó)腫瘤登記地區(qū)，膀胱癌發(fā)病率7.49/104，占中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病的2.5%[1]。移行細(xì)胞癌是膀胱癌的主要病理類型，其復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高，對(duì)腫瘤的一級(jí)、二級(jí)預(yù)防有效等特點(diǎn),決定了其是化學(xué)預(yù)防干預(yù)的理想模型[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，順鉑被認(rèn)為是治療移行細(xì)胞癌的一種重要化療藥物，但順鉑單藥化療的總體反應(yīng)率高達(dá)35%左右[3]。因此尋找一種新的藥物來(lái)增強(qiáng)膀胱癌的化療效果顯得尤其重要。

大黃素是大黃的一種重要有效單體，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，大黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用[4-6]，但大黃素是否可以增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌的化療作用目前尚鮮見報(bào)道。本研究通過(guò)建立裸鼠膀胱癌移植瘤模型，并聯(lián)合大黃素和順鉑共同作用，探討大黃素是否可以提高增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑大黃素(emodin,純度>98%，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)溶解于DMSO濃度<0.1%(體積分?jǐn)?shù))的生理鹽水中。順鉑(Cisplatin，Cis),購(gòu)于齊魯制藥有限公司。Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于Fermentas。兔抗人腫瘤組織核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)抗體、凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)抗體和胱天蛋白酶(Caspase-3)抗體購(gòu)于abcam公司。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2(體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)箱中。使用添加有10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))并100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)使用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 動(dòng)物4～6周齡BALB/c nu/nu雄性裸小鼠32只，體重20～22 g，購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，控制室溫在(25±1) ℃，相對(duì)濕度40%～60%，使用滅菌處理過(guò)的飼料。

1.4 模型建造和實(shí)驗(yàn)方案收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞懸液，將其細(xì)胞懸液注射于裸鼠背部靠近后肢部位的皮下，每只注射0.2 mL約5×106個(gè)細(xì)胞。

2周后，將裸鼠按腫瘤體積大小排序并隨機(jī)分成4組，每組8只：Con組(生理鹽水)、Cis組(順鉑50 mg/kg)、Emo(Emodin)組(大黃素40 mg/kg)[7]和Cis+Emo組(聯(lián)合用藥，順鉑50 mg/kg和大黃素40 mg/kg)。腹腔注射給藥，每3 d 1次，共8次。每次用藥前及處死裸鼠前均稱量裸鼠體重并測(cè)量腫瘤短徑(a)和長(zhǎng)徑(b)。腫瘤體積計(jì)算公式按照v=π/6×a2×b。末次用藥1周后用10%水合氯醛麻醉裸鼠取部分腫瘤組織置于4%多聚甲醛固定，留取部分新鮮組織保存于液氮備用。

1.4.1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(transferase-mediated nick end labeling，TUNEL)l試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，加tunel反應(yīng)液37℃孵育1 h后封片，用激光共聚焦顯微鏡400倍下進(jìn)行拍照，每張切片均尋找10個(gè)典型視野。以不含標(biāo)本的空白玻片做為對(duì)照。

1.4.2 免疫組化 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、XIAP(X染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白)XIAP和Caspase-3對(duì)各組標(biāo)本的同一橫截面進(jìn)行連續(xù)切片，所得石蠟切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.3%H2O2封閉，微波抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，兔抗人Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育半小時(shí)，DAB顯色3～5 min，沖洗后蘇木素復(fù)染，流水沖洗返藍(lán)后梯度乙醇脫水封片鏡檢。

1.4.3 RNA提取及RT-PCR 按照說(shuō)明書所描述的步驟，用Trizol試劑提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的RNA測(cè)濃度。使用1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，將所得模板取1 μL行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物置于0.5%瓊脂糖凝膠電泳并成像。所用的引物序列如表1。表中GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。

表1 RT-PCR所用的引物序列

基因引物序列產(chǎn)物大小NF-κB300bp 上游5'-CCTGCACTCAATCAAGAAGTTGC-3' 下游5'-TTCCTGCTCTGTTTGGTGAGGCT-3'XIAP259bp 上游5'-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3' 下游5'-GCAACGCGAGTCTGTGTTTTTG-3'Capase-3309bp 上游5'-AGCAAACCTCAGGGAAACATT-3' 下游5'-GTCTCAATGCCACAGTCCAGT-3'GAPDH216bp 上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3' 下游5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'

2 結(jié) 果

2.1 末次用藥后1周各組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量的變化末次用藥后 1周，各組腫瘤質(zhì)量和體積如表2所示。與對(duì)照組相比，Emo組與Cis組的瘤體平均體積均明顯小于對(duì)照組 (P<0.05)，但Cis+Emo組抑制腫瘤的作用更為明顯，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 大黃素增強(qiáng)順鉑對(duì)T24細(xì)胞移植瘤的抑瘤作用

2.2 大黃素增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用 Tunel陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核發(fā)出黃綠色熒光，通過(guò)對(duì)比各組中黃綠色熒光的累積吸光度值，可以發(fā)現(xiàn)，與其他3組相比，Cis+Emo組累積吸光度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、表2)。

組別腫瘤體積(mm3)腫瘤質(zhì)量(g) 累積光密度值Con組473.7±69.10.373±0.0841984±273Cis組348.5±53.5*0.224±0.083*3441±372*Emo組360.8±95.4*0.264±0.041*2471±129*Cis+Emo組263.9±73.1#0.169±0.071#6235±332#F值3.282.884.61P值0.0160.0270.001

*與Con組相比，P<0.05；#與其他3組相比，P<0.05。

圖2 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光)。

2.3 免疫組化法檢測(cè)NF-κB、XIAP、Caspase-3蛋白在各組腫瘤組織中的表達(dá)應(yīng)用IPP軟件對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行分析，各組腫瘤組織中NF-κB和P-g p蛋白的表達(dá)量以平均光密度值的形式表示，各組平均光密度值見圖3、表3。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)NF-κB、XIAP和Caspase-3 mRNA在各組腫瘤中的表達(dá)量大黃素可以顯著下調(diào)NF-κB和XIAP mRNA的表達(dá)量，增強(qiáng)Caspase-3 mRNA的表達(dá)量(圖4、表4)。

表3 免疫組化法檢測(cè)NF-κB、XIAP、Caspase-3蛋白在各組腫瘤組織中的表達(dá)

組別NF-κB XIAP Caspase-3Con0.55±0.0650.43±0.0910.21±0.064Cis0.62±0.0350.46±0.0730.34±0.093Emo0.41±0.081*0.22±0.11*0.41±0.81*Cis+Emo0.39±0.11#0.31±0.072#0.72±0.12#F值5.217.7310.27P值0.0290.0180.033

*與Con組相比，P<0.05；#與其他3組相比，P<0.05。

組別NF-κBXIAPCaspase-3Con111Cis1.21±0.411.36±0.231.67±0.43△Emo 0.3±0.08*0.48±0.11*1.34±0.21△Cis+Emo0.29±0.10*0.36±0.12*2.36±0.57#F值9.243.087.20P值0.0060.0460.021

與Con組和Cis組相比，*P<0.05；與其他3組相比，#P<0.05；與Con組相比，△P<0.05。

3 討 論

目前非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的主要治療方法是經(jīng)尿道電切術(shù)；術(shù)后需要長(zhǎng)時(shí)間的膀胱灌注化療來(lái)預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)，然而由于內(nèi)源性或獲得性的耐藥，單藥化療往往難以阻止腫瘤的復(fù)發(fā)。對(duì)于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，多藥聯(lián)合化療的方案優(yōu)于單藥灌注療法，但其復(fù)發(fā)率仍然居高不下[8]。因此尋找一種新的藥物來(lái)增強(qiáng)膀胱癌的化療效果顯的尤其重要。

大黃素(Emodin，6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌)，是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來(lái)的主要有效單體。大黃素可作用于癌細(xì)胞中癌基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其促凋亡作用對(duì)癌細(xì)胞有效，正常細(xì)胞則不敏感[9]。大黃素可以抑制胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4-6，10]。在胰腺癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，大黃素可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)吉西他濱的化療作用[11]。其機(jī)制均為作用于腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在基因和蛋白水平上影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

凋亡是細(xì)胞內(nèi)在的死亡程序，它參與細(xì)胞的許多病理生理進(jìn)程，在生物細(xì)胞中具有高度的保守性[12]。參與細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩條，一是內(nèi)源性的死亡受體通路，一是外源性的線粒體通路。胱天蛋白酶家族-Caspase蛋白參與這兩條通路當(dāng)中，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。人體腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)就是對(duì)那些可以在敏感細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的因素產(chǎn)生耐受，使得腫瘤細(xì)胞免于凋亡，進(jìn)入無(wú)限增殖的程序[13]。NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體免疫、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NF-κB在腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]，XIAP(X染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白)是一種凋亡抑制因子，它可以通過(guò)抑制Caspase家族蛋白的活性來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用，事實(shí)表明，XIAP的過(guò)量表達(dá)是腫瘤細(xì)胞化療效果不好的重要原因之一[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大黃素和順鉑聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡程度明顯高于順鉑單藥組，從而增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。大黃素的促凋亡作用是通過(guò)下調(diào)NF-κB及XIAP的表達(dá)量，上調(diào)Caspase-3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，大黃素聯(lián)合順鉑可以增強(qiáng)膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤誘導(dǎo)凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)表明其機(jī)制可能是通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，下調(diào)XIAP基因的表達(dá)，并使膀胱癌細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)了化療效果。本研究將為大黃素聯(lián)合順鉑治療膀胱癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為膀胱癌的臨床治療開辟新的途徑。

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(編輯 何宏靈)

Emodin enhances the antitumor effect of cisplatin on bladder cancer T24 cell xenografts

MA Yong,ZHANG Gui-ming,SUN Li-jiang

(Department of Urology,the Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266021,China)

Objective To investigate the enhancement effect of cisplatin on the chemoresistance of T24 cell xenograft. Methods The models of T24 cell xenograft on athymic mice were established and randomized into four groups with intraperitoneal (IP) injection of different drugs: group Con (0.9% sodium chloride), group Cis (cisplatin, 50 mg/kg), group Emo (emodin, 40 mg/kg) and group Cis+Emo (cisplatin,50 mg/kg; emodin, 40 mg/kg). The drugs were injected once per three days, eight times in all. The tumor volume was measured during the drug therapy. The mice were sacrificed one week after the last injection. Immunohistochemistry (IHC) was performed to detect the expression of NF-κB, XIAP and Caspase-3 proteins. RT-PCR was used to detect the expression of NF-κB, XIAP and Caspase-3 mRNA. Results One week after the last administration, the mean tumor volume and tumor weight in group Cis+Emo were significantly decreased as compared to the other groups. RT-PCR analysis showed the expression of NF-κB and XIAP mRNA in Emo and Cis+Emo groups were significantly downregulated. IHC analysis showed the expression of NF-κB and XIAP were downregulated in Emo and Cis+Emo groups compared to the other two groups. Conclusions Emodin can enhance the antitumor effect of cisplatin on bladder cancer T24 cell xenograft. Apoptosis promotion is possibly one of the mechanisms.

eemodin; cisplatin; chemoresistance;bladder cancer; NF-κB; XIAP; Caspase-3;apoptosis

2014-10-29

2015-01-26

孫立江，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師.E-mail：slijiang999@sohu.com

馬勇(1978-)，男(漢族)，博士研究生.研究方向：泌尿系統(tǒng)腫瘤.E-mail：coralmy@163.com

R737.14

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-04-015