徐小川，姚源，田偉，石銳，陳大福，張秀麗(北京積水潭醫(yī)院，北京0005；北京市創(chuàng)傷骨科研究所；北京市第六醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

新型誘導(dǎo)成骨可降解生物材料增塑淀粉骨埋植的生物安全性觀察

徐小川1，姚源1，田偉2，石銳2，陳大福2，張秀麗3(1北京積水潭醫(yī)院，北京100035；2北京市創(chuàng)傷骨科研究所；3北京市第六醫(yī)院)

摘要：目的評(píng)估新型誘導(dǎo)成骨可降解生物材料增塑淀粉的生物安全性。方法以12只新西蘭兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用自身左右對(duì)照的方式在其雙側(cè)脛骨平臺(tái)分別埋植增塑淀粉和S-99可溶性止血紗布。觀察4周、8周、12周三個(gè)階段手術(shù)區(qū)骨組織相容性。結(jié)果所有觀察期雙側(cè)手術(shù)區(qū)肉眼觀察未見充血紅腫及骨膜增厚，組織學(xué)觀察未出現(xiàn)骨吸收及骨破壞。結(jié)論增塑淀粉的骨組織相容性較好。

關(guān)鍵詞：增塑淀粉；成骨材料；骨埋植；生物相容性評(píng)價(jià)；兔

海藻酸鹽是一種從海洋褐藻中分離出來(lái)的天然多糖。由于良好的生物相容性被廣泛應(yīng)用在藥物和組織工程等醫(yī)療領(lǐng)域，如藥物緩控釋系統(tǒng)的骨架結(jié)構(gòu)[1]和凝膠狀組織工程載體或支架材料[2，3]，但其凝膠在生理環(huán)境中容易溶解而失去凝膠特性，此過(guò)程難以控制和預(yù)測(cè)；同時(shí)，因其具有較強(qiáng)的親水性故對(duì)蛋白質(zhì)吸附較差，缺乏細(xì)胞特異性作用位點(diǎn)，大量研究著力于海藻酸鹽的改性。增塑淀粉是北京化工大學(xué)研發(fā)的彈性體生物材料，增塑后普通淀粉的強(qiáng)度和彈性大大增加[4]。該材料分子量巨大、纏繞點(diǎn)多、對(duì)小分子具有超強(qiáng)包容性，可作為替代海藻酸鹽的可降解材料，通過(guò)加入骨誘導(dǎo)因子，易成為具有止血及誘導(dǎo)成骨雙重作用的組織工程材料[5]。骨埋植試驗(yàn)，是體內(nèi)試驗(yàn)的一種，即將材料通過(guò)外科手術(shù)植入到動(dòng)物的骨組織中，一定時(shí)期后通過(guò)光學(xué)或電子顯微鏡觀察評(píng)價(jià)材料對(duì)活體組織的局部毒性作用，可以觀察組織與材料的接觸界面以及骨吸收和骨形成情況。依照YY/T 0127.4-1998[6]，2006年1月～2007年10月我們采用自身對(duì)照方式對(duì)增塑淀粉進(jìn)行骨埋植試驗(yàn)，觀察增塑淀粉的生物安全性。

1材料與方法

1.1材料體質(zhì)量2.5 kg的健康家兔12只，4周、8周、12周3個(gè)試驗(yàn)期各4只。實(shí)驗(yàn)部位為家兔雙側(cè)脛骨平臺(tái)。

1.2方法

1.2.1植入物的準(zhǔn)備依照YY/T 0127.4—1998標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)材料需填裝入直徑1.5 mm，長(zhǎng)5 mm的膠管內(nèi)。選用臨床使用的輸液器膠管，制成規(guī)定形狀，膠管植入前經(jīng)高溫高壓消毒。增塑淀粉經(jīng)鈷60照射消毒備用，對(duì)照組為S-99可溶性止血紗布(金臺(tái)牌，北京紡織科學(xué)研究所)。

1.2.2手術(shù)方法采用自身左右對(duì)照方式，一側(cè)埋置實(shí)驗(yàn)材料，另一側(cè)為對(duì)照材料。全身麻醉后于股骨外側(cè)、脛骨內(nèi)側(cè)備皮，用濃度為25 g/L的碘酒及75%(V/V)乙醇對(duì)術(shù)區(qū)消毒，逐層切開并分離皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜。用齒科低速鉆在脛骨平臺(tái)骨皮質(zhì)上鉆孔，同時(shí)用生理鹽水冷卻。左側(cè)脛骨為實(shí)驗(yàn)側(cè)，右側(cè)為對(duì)照側(cè)。每側(cè)術(shù)區(qū)最多制備3個(gè)孔，孔間距應(yīng)>8 mm，孔直徑為2 mm，穿透一側(cè)骨皮質(zhì)達(dá)骨髓腔。將充填好材料的膠管指壓插入相應(yīng)預(yù)制孔內(nèi)，逐層縫合肌筋膜、皮下組織及皮膚。

1.2.3指標(biāo)觀察方法

1.2.3.1大體觀察于手術(shù)后4、8、12周取材，肉眼觀察并記錄植入體周圍組織情況并與對(duì)照材料相應(yīng)區(qū)域比較。

1.2.3.2組織學(xué)觀察相應(yīng)時(shí)間切取包含植入體及其周圍組織的組織塊，3%甲醛液固定，脫鈣，常規(guī)系列乙醇脫水，石蠟包埋；垂直植入體長(zhǎng)軸進(jìn)行連續(xù)切片，HE染色。記錄以下反應(yīng)指標(biāo)：①纖維化/纖維性包裹及炎癥范圍；②組織形貌變化、變性；③從材料/組織界面處觀察炎癥細(xì)胞類型(如多核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及多核細(xì)胞)、數(shù)量及距界面分布的距離；④組織壞死，如細(xì)胞核出現(xiàn)碎片和(或)血管壁破裂；⑤材料碎屑、脂肪浸潤(rùn)、肉芽腫；⑥骨與材料接觸情況，界面有無(wú)非礦化組織存在，有無(wú)骨吸收及骨形成。

2結(jié)果

2.1大體觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后活動(dòng)正常，進(jìn)食好，傷口一期愈合無(wú)傷口感染。4周取材大體標(biāo)本可見實(shí)驗(yàn)側(cè)、對(duì)照側(cè)脛骨平臺(tái)鉆孔區(qū)附近組織無(wú)充血紅腫，無(wú)骨膜增厚，膠管與骨皮質(zhì)未結(jié)合，膠管內(nèi)有部分軟組織長(zhǎng)入。術(shù)后8及12周兩個(gè)階段實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)膠管與骨組織間可見明顯間隙，膠管外覆蓋纖維包膜，膠管內(nèi)容物完全由軟組織替代。

2.2組織學(xué)觀察結(jié)果術(shù)后4、8、12周所有觀察期各視野均未出現(xiàn)骨吸收、骨破壞。4周實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)與骨組織界面清晰，對(duì)照側(cè)可見出血細(xì)胞(插頁(yè)Ⅱ圖3)，8周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)有炎性反應(yīng)(插頁(yè)Ⅱ圖4)，12周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)未見異常而對(duì)照側(cè)有白細(xì)胞(插頁(yè)Ⅱ圖5)。

3討論

體內(nèi)植入試驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)活體組織與試驗(yàn)樣品材料的相互反應(yīng)，是評(píng)價(jià)生物材料生物相容性和安全性的重要體內(nèi)方法。所有醫(yī)療器械和材料植入體內(nèi)，均會(huì)不同程度地產(chǎn)生組織反應(yīng)。對(duì)局部組織的生物學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)列出了系列指標(biāo)，目前，國(guó)內(nèi)常采用的肌肉或皮下局部組織生物學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)是根據(jù)炎性細(xì)胞反應(yīng)和纖維形成進(jìn)行組織反應(yīng)分級(jí)，然后再根據(jù)組織反應(yīng)分級(jí)情況進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。對(duì)于骨組織植入試驗(yàn)，主要觀察組織與材料的接觸界面以及骨吸收和骨形成情況。

一般機(jī)體對(duì)植入物材料的短期反應(yīng)主要有修復(fù)反應(yīng)、炎性反應(yīng)和免疫刺激等。材料植入若主要誘發(fā)機(jī)體修復(fù)反應(yīng)，提示材料的生物相容性和安全性好，反之，若顯示炎癥、排斥甚至組織壞死，則認(rèn)為材料的安全性需要提高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照材料12周組織學(xué)觀察到白細(xì)胞提示該材料安全性還可以進(jìn)一步完善。

實(shí)驗(yàn)觀察周期的選擇參考ISO10993 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)，第六部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)》[6]和國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0127.4-1998醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)匯編(口腔材料卷)，第一個(gè)文件建議觀察期設(shè)為1～12周，第二個(gè)推薦4～26周。Kolambkar等[7]用大鼠股骨缺損為模型，利用固體支架連接兩端在缺損區(qū)注入海藻酸水凝膠復(fù)合 BMP-2及單純海藻酸材料，8周后即可進(jìn)行最大扭矩等力學(xué)測(cè)試[7]。李平[8]、Priddy等[9]發(fā)現(xiàn)，12周時(shí)已經(jīng)可以對(duì)生物相容性做出判斷。基于上述研究者的工作，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有選擇更長(zhǎng)的觀察時(shí)間；但過(guò)短時(shí)間局部組織尚處于創(chuàng)傷修復(fù)期，觀察意義不大，因此，未選擇1～3周的觀察期。

本研究結(jié)果表明，增塑淀粉的骨組織相容性符合相應(yīng)的國(guó)家醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但是，海藻酸鹽、增塑淀粉等材料不易塑形且在體內(nèi)容易遷散而不能用于恢復(fù)需要的骨缺損形態(tài)[10]。組織工程可將種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和測(cè)試材料三要素復(fù)合，因此，本材料還需要進(jìn)一步完善才能在臨床使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張強(qiáng)，武鳳蘭.藥劑學(xué)——緩釋與控釋技術(shù)[M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2004：505-537.

[2] 顧耕華，何虹，黃劍奇.海藻酸鈣膜引導(dǎo)兔頜骨缺損骨再生的對(duì)照實(shí)驗(yàn)[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)，2002，16(5):388-390.

[3] 郭全義，盧士璧，張莉，等.藻酸鈣凝膠為載體體外短期培養(yǎng)軟針細(xì)胞的生物學(xué)性狀[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(1)：61-63.

[4] Lourdin D, Bizot H, Colonna P. “Antiplasticization”in starch-glycerol films[J]. J Applied Polymer Science, 1997,63(8):1047-1053.

[5] 朱愛(ài)臣，石銳，陳大福，等.淀粉/聚乙烯醇復(fù)合生物膜的制備及其表征[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(8)：1441-1447.

[6] 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室. 醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)匯編(口腔材料卷)[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002:25-27.

[7] Kolambkar YM, Dupont KM, Boerckel JD, et al. An alginate-based hybrid system for growth factor delivery in the functional repair of large bone defects[J]. Biomaterials， 2011，32(1):65-74.

[8] 李平，肖麗英，李偉,等.納米羥基磷灰石根充糊劑動(dòng)物根管充填及頜骨和皮下埋植實(shí)驗(yàn)[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)，2007,23(6):793-796.

[9] Priddy LB, Chaudhuri O, Stevens HY， et al. Oxidized alginate hydrogels for bone morphogenetic protein-2 delivery in long bone defects[J]. Acta Biomater, 2014,10(10):4390-4399.

[10] 李宜芬, 姜婷.溫敏海藻酸復(fù)合凝膠用于非承重區(qū)牙槽嵴隧道注射法骨擴(kuò)增的研究[D].北京:北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，2013:9-22.

(收稿日期：2014-06-15)

中圖分類號(hào)：R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)04-0024-02

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.008

通信作者：田偉，E-mail: tianweia@163bj.com

基金項(xiàng)目：北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2061002)。