李璟等

摘 要 觀察多級(jí)氧濃度對(duì)體外培養(yǎng)條件下小鼠原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞、小鼠3T3-L1前脂細(xì)胞及大鼠BRL肝細(xì)胞生長的影響，探究不同類型細(xì)胞體外增殖的最佳O2體積分?jǐn)?shù)以及對(duì)低氧和高氧耐受力的差異.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在10%～18%O2范圍內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖最快、活力最強(qiáng)，而3T3-L1前脂細(xì)胞及BRL肝細(xì)胞生長的最適O2體積分?jǐn)?shù)為5%.O2濃度過低嚴(yán)重?fù)p害這幾種細(xì)胞在培養(yǎng)下的生存能力，O2濃度過高有致死性毒性作用.這些結(jié)果表明，原代與長期傳代細(xì)胞最佳生長的適宜氧濃度有一定的差異，對(duì)低氧和高氧的耐受力也強(qiáng)弱不同.

關(guān)鍵詞 氧濃度；細(xì)胞培養(yǎng)；增殖；細(xì)胞活力

中圖分類號(hào) Q256 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2014）06-0013-06

Abstract The effects of various oxygen concentrations on population growth of mouse bone-marrow primary stromal cells， murine 3T3-L1 preadipocytes and rat BRL hepatocytes during the 48 h-culture period were examined in order to explore the optimal oxygen concentration and difference in tolerance limits to hypoxia and hyperoxia for cell proliferation in vitro. The results show that the primary stromal cells had the highest proliferative activity and greatest viability at oxygen concentrations of 10% and 18%， while 3T3-L1 preadipocytes and rat BRL hepatocytes did at oxygen concentration of 5%. Too low oxygen greatly impaired survival of these cell types， and too high oxygen exerted lethal toxicity on them. These data suggest that the primary cells and the immortal cell lines require different concentrations of oxygen for their optimal growth， and they have different tolerance limits to hypoxia and hyperoxia as well.

Key words oxygen concentration； cell culture； proliferation； cell viability

氧是細(xì)胞生存的必要條件之一，也是細(xì)胞生物學(xué)行為和生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子[1-2].細(xì)胞在體外培養(yǎng)下的生存和生長也必須有適宜的氧濃度，細(xì)胞培養(yǎng)本身又是研究氧生物學(xué)作用的重要方法.然而，多種細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的最適氧濃度還不確定，不同氧濃度對(duì)細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不完全清楚.細(xì)胞的類型和機(jī)能狀態(tài)、技術(shù)條件等因素都可影響細(xì)胞對(duì)氧濃度變化的反應(yīng)[3-5].本文利用作者所在實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞體外培養(yǎng)的一種新方法，研究不同氧濃度對(duì)幾種原代和傳代細(xì)胞生長的影響，為體外細(xì)胞培養(yǎng)最適氧體積分?jǐn)?shù)的選擇和與氧相關(guān)細(xì)胞病理及生理的深入研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系

昆明種小鼠，雌雄不限，4周齡，體重18～22 g，購于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部；小鼠前脂細(xì)胞3T3-L1系和大鼠肝細(xì)胞BRL系分別由本院心臟發(fā)育研究室和衰老生物化學(xué)研究室惠贈(zèng).

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen-Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和胰蛋白酶（typsin）為Sigma產(chǎn)品.

13 方法

1.3.1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下分離出股骨和脛骨，用DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓.依次用6、5、4號(hào)針頭吸打沖出的骨髓，制成單細(xì)胞懸液，作有核細(xì)胞計(jì)數(shù).骨髓有核細(xì)胞于20%（體積分?jǐn)?shù)）FBS的DMEM培養(yǎng)液中，以1×107/mL的細(xì)胞密度種入12.5 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng).48h后吸出上懸液中未貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞用于不同氧濃度條件下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

1.3.2 MSC集落形成實(shí)驗(yàn) 取上述小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，調(diào)有核細(xì)胞密度為2×106/mL，接種于12.5 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL，培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境條件同前.48 h后換液，采用本研究室所創(chuàng)培養(yǎng)器皿內(nèi)定量混配氣體的抽氣-注氣法（專利申報(bào)中），在培養(yǎng)瓶中配制不同體積分?jǐn)?shù)的6組混合氣體：1%O2、5%O2、10%O2、18%O2（標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱內(nèi)O2體積分?jǐn)?shù)）、30%O2、95%O2組.細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，Wright-Giemsa 染色.光鏡下計(jì)數(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）集落個(gè)數(shù)（≥10個(gè)成纖維樣細(xì)胞的聚合計(jì)為1個(gè)集落），點(diǎn)析分法測(cè)算平均集落面積.

1.3.3 小鼠3T3-L1細(xì)胞系和大鼠BRL肝細(xì)胞系的傳代培養(yǎng) 將凍存于液氮的3T3-L1細(xì)胞和BRL肝細(xì)胞復(fù)蘇，種入12.5 cm2培養(yǎng)瓶，在上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，每3 d換液，細(xì)胞貼壁生長接近融合狀態(tài)時(shí)，用胰蛋白酶消化法作分瓶傳代.獲得足夠細(xì)胞時(shí)，取60%左右融合狀態(tài)的細(xì)胞，做不同氧濃度條件下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

1.3.4 不同氧濃度培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng) 將上述骨髓基質(zhì)細(xì)胞、3T3-L1細(xì)胞和BRL肝細(xì)胞分為6個(gè)組進(jìn)行培養(yǎng)，各組氣相培養(yǎng)環(huán)境的CO2體積分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)基和溫度同前.

1.3.5 骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)時(shí)觀察和拍照 在骨髓基質(zhì)細(xì)胞受不同氧濃度處理前（0 h）和處理后12、24、48 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照.

1.3.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化法收獲貼壁細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出每培養(yǎng)瓶的細(xì)胞總數(shù).

1.3.7 MTT比色法 用胰蛋白酶消化法收取培養(yǎng)48 h的各氧濃度組細(xì)胞，每一12.5 cm2培養(yǎng)瓶均收獲2 mL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入96孔板，0.5 mL/孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL孵育4 h，吸棄懸液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），避光輕輕振蕩15 min.用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)取各孔的490 nm吸光值.

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.用SPSS 13.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，SigmaPlot軟件作圖.

2 結(jié)果

2.1 不同氧體積分?jǐn)?shù)下骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

各組小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在48 h培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化如圖1所示.18%O2組細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)最好，細(xì)胞伸展較長較寬，胞體明亮；隨時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量增加.在O2體積分?jǐn)?shù)小于18%的3個(gè)組，細(xì)胞形態(tài)與18%O2組基本相同，但隨氧濃度降低和培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞伸展的長度和寬度略為變小，細(xì)胞亮度漸見減低.10%O2組細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，但增速略小于18%O2組；5%O2和1%O2組的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，且1%O2組的細(xì)胞數(shù)目減少較快.在O2體積分?jǐn)?shù)大于18%的兩個(gè)組中，30%O2組細(xì)胞形態(tài)的變化與小于18%O2組相似，細(xì)胞數(shù)量漸見減少；而95%O2組細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長較快地變圓，數(shù)量快速減少，培養(yǎng)至24 h，只觀察到少數(shù)細(xì)胞沉于瓶底及漂浮在懸液中，至48 h，視野中的細(xì)胞所剩無幾.

2.2 不同氧體積分?jǐn)?shù)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外增殖和活力的影響

注：柱上方的連線表示18%O2組與其余各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；柱上方標(biāo)記相同字母表示對(duì)應(yīng)兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，下同.

各組小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，18%O2組細(xì)胞計(jì)數(shù)最多、MTT試驗(yàn)吸光值最高.與18%O2組比，10%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)吸光值無明顯差異.5%O2和1%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)吸光值均顯著低于18%O2組和10%O2組；1%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)指標(biāo)比5%O2組更低，兩組之間的差異也有顯著性意義.與18%O2組或10%O2組比，30%O2和95%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)吸光值都顯著減低，95%O2組減低程度更大，30%O2組與95%O2組之間的差異也有顯著性（圖2）.

2.3 不同氧體積分?jǐn)?shù)對(duì)MSC集落形成的影響

如表1、圖3所示，18%O2組的小鼠骨髓MSC集落形成率高于其余組，而10%O2組的MSC平均集落面積高于其余組；18%O2組與10%O2組之間，這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)無明顯差異.與18%O2組或10%O2組比，5%O2組和1%O2組的集落形成率均顯著減低，1%O2組的集落形成率還顯著低于5%O2組；O2體積分?jǐn)?shù)低于10%后，平均集落面積隨O2體積分?jǐn)?shù)降低而減小，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性.30%O2組的集落形成率顯著低于18%O2組或10%O2組；平均集落面積也減小，但沒有顯著性意義.95%O2組無集落生成.

2.4 不同氧體積分?jǐn)?shù)對(duì)3T3-L1細(xì)胞體外增殖和活力的影響

培養(yǎng)48 h后，5%O2組的3T3-L1細(xì)胞計(jì)數(shù)最多、MTT試驗(yàn)吸光值最高.其余各組與5%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)吸光值差異均有顯著性.在10%、18%、30%和95%組，隨O2體積分?jǐn)?shù)遞增，3T3-L1細(xì)胞數(shù)遞減，兩兩組間差異均有顯著性意義；MTT試驗(yàn)吸光值也隨O2體積分?jǐn)?shù)遞增而遞減，10%O2組與30%O2組、30%O2組與95%O2組、95%O2組與其余3組之間的差異具有顯著性（圖4）.

2.5 不同氧體積分?jǐn)?shù)對(duì)大鼠BRL肝細(xì)胞體外增殖和活力的影響

培養(yǎng)48 h后，各組BRL肝細(xì)胞增殖和活力狀況與3T3-L1細(xì)胞相似，5%O2組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT試驗(yàn)吸光值高于其余各組；與5%O2組比，除1%O2組細(xì)胞數(shù)的減少無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余指標(biāo)的差異均有顯著性.在10%、18%、30%和95%O2組，BRL肝細(xì)胞的計(jì)數(shù)值和MTT試驗(yàn)吸光值都隨O2體積分?jǐn)?shù)遞增而遞減，95%O2組與其余3組之間的細(xì)胞數(shù)差異具有顯著性，兩兩組間的MTT試驗(yàn)吸光值差異均有顯著性意義（圖5）.

3 討論

人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的氣相環(huán)境條件一般是恒溫37 ℃，含5%～10%CO2及飽和水蒸汽的空氣[6].在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，人們普遍將標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱內(nèi)空氣的O2體積分?jǐn)?shù)作為細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境的正?；虺Ｒ?guī)氧體積分?jǐn)?shù)，簡稱常氧（normoxia）.低于和高于常氧的氧濃度分別稱為低氧（hypoxia）和高氧（hyperoxia）[2].氧條件變化對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響已有大量研究，其中主要是低氧研究.由于現(xiàn)有技術(shù)條件及費(fèi)用的限制，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的氧條件往往較少，很少在同一培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中研究低氧和高氧對(duì)細(xì)胞的影響[7].本工作應(yīng)用所在研究室所創(chuàng)培養(yǎng)器皿內(nèi)建立氣相條件的新方法，觀察多個(gè)氧條件對(duì)不同類型細(xì)胞體外增殖的影響.其中，18%O2為培養(yǎng)箱內(nèi)溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%條件下的氧體積分?jǐn)?shù)（本實(shí)驗(yàn)所用CO2培養(yǎng)箱為Forma 3110型，氧傳感器實(shí)測(cè)O2體積分?jǐn)?shù)顯示（17.6±5）%）.需要說明的是，很多文獻(xiàn)稱標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱內(nèi)的氧體積分?jǐn)?shù)是21%，或認(rèn)為是19.95%；前者即空氣中的氧體積分?jǐn)?shù)，后者是考慮到培養(yǎng)箱氣相空間內(nèi)CO2占了5%的體積.但后者還忽略了培養(yǎng)箱內(nèi)的飽和水蒸汽，如37 ℃的一個(gè)大氣壓氣相空間，飽和水蒸汽的體積分?jǐn)?shù)約為6%.因此，在普通CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37 ℃、CO2為5%的條件下，較精確的O2體積分?jǐn)?shù)為187%，或約為18%[8].

近年來，人們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的“常氧”提出了疑問，因?yàn)樵谶@種條件下細(xì)胞周圍培養(yǎng)基的氧條件與正常組織中不符.平均而言，正常人體和哺乳動(dòng)物組織中的氧體積分?jǐn)?shù)約為5%（PO2 40 mmHg），遠(yuǎn)低于常氧培養(yǎng)條件下細(xì)胞周圍的氧濃度.而且，組織中不同區(qū)間或不同類型細(xì)胞微環(huán)境的氧條件又有差異.例如骨髓內(nèi)干細(xì)胞微環(huán)境的氧體積分?jǐn)?shù)測(cè)定值，在間充質(zhì)干細(xì)胞壁龕中為2%～8%，在造血干細(xì)胞壁龕中為1%～6%[2].由此可知，在機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)下不同類型細(xì)胞具有自身微環(huán)境的氧條件.有人新造了生理氧（physioxia）這一術(shù)語，以區(qū)別于常氧.掌握體外培養(yǎng)下各種細(xì)胞相應(yīng)的最適氧條件，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、氧相關(guān)細(xì)胞生理和病理的研究都至關(guān)重要.

本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）、小鼠3T3-L1前脂細(xì)胞及大鼠BRL肝細(xì)胞為受試對(duì)象，除了用原代細(xì)胞和長期傳代細(xì)胞作比較研究之外，還考慮了在組織內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞一般處于分裂休止或停滯狀態(tài)下耗氧率較低； 3T3-L1細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞同屬間充質(zhì)譜系；肝細(xì)胞的代謝活躍，耗氧率較高[9].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這幾種細(xì)胞最佳生長的適宜氧體積分?jǐn)?shù)有明顯差異.在10%～18%O2下，骨髓基質(zhì)細(xì)胞的活力最強(qiáng)、增殖最快；而對(duì)于3T3-L1細(xì)胞系及大鼠BRL肝細(xì)胞系，生長的最適氧條件為5%.當(dāng)氧條件顯著低于或高于各種細(xì)胞相應(yīng)的最適水平時(shí)，細(xì)胞的生長乃至存活受到不利的影響.

低氧培養(yǎng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用幾種細(xì)胞的影響已有一些研究.徐承熊等[10]較早報(bào)道在5%O2下小鼠骨髓基質(zhì)集落形成細(xì)胞（CFU-F）形成率顯著增高.最近，Berniakovich等[11]的研究顯示，3%O2促進(jìn)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外增殖和集落形成.此外，Valorani等[12]在2%O2條件下培養(yǎng)小鼠脂肪組織MSCs，觀察到增殖速率高于常氧條件.而且，不少研究者報(bào)道低氧有利于人骨髓MSCs的生長，也有研究顯示低氧對(duì)大鼠、綿羊、家兔MSCs具有促增殖作用[13-14].然而，有兩個(gè)研究組分別報(bào)告，低氧通過影響細(xì)胞周期運(yùn)行而抑制人MSCs的體外增殖[15-16].近來，Chung等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5%和1%O2的培養(yǎng)條件下，狗骨髓和脂肪組織MSCs的增殖都受到負(fù)性影響.至今，尚未見低氧培養(yǎng)抑制小鼠MSCs生長的研究報(bào)道.本研究的培養(yǎng)實(shí)時(shí)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT比色測(cè)定和MSC集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在≤5%O2的培養(yǎng)條件下，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖抑制.低氧對(duì)細(xì)胞生長的影響有不一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與多種因素有關(guān)，細(xì)胞本身的差異可能是重要的原因.本研究的結(jié)果表明，與5%O2培養(yǎng)條件相比，3T3-L1前脂細(xì)胞及BRL肝細(xì)胞在1%O2條件下的細(xì)胞活力減低和增殖抑制.與這一結(jié)果不同，Macfarlane等[18]的實(shí)驗(yàn)顯示，3T3-L1細(xì)胞系在5%O2培養(yǎng)條件下即發(fā)生生長抑制.Yin等[19]則報(bào)告1%O2培養(yǎng)導(dǎo)致3T3-L1細(xì)胞壞死和凋亡.關(guān)于培養(yǎng)體系中氧濃度降低對(duì)肝細(xì)胞活力和生長的影響，不同實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果也不一致[20-21].

高氧對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用幾種細(xì)胞影響的研究報(bào)道甚少.據(jù)迄今為止的文獻(xiàn)檢索，尚無骨髓基質(zhì)細(xì)胞在高氧下培養(yǎng)的研究，一個(gè)密切相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是Gomez等[22]將2月齡雌性小鼠暴露于高壓氧（2.8 atm）或常壓純氧，每天90 min，連續(xù)5 d之后，骨髓CFU-F形成率顯著高于對(duì)照組.關(guān)于高氧培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞存活和生長的影響，幾個(gè)研究組分別報(bào)道了正性或負(fù)性結(jié)果[23-24].不過，在這幾組實(shí)驗(yàn)中，高氧水平、壓強(qiáng)和處理時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件不盡相同.這些因素與細(xì)胞高氧暴露效應(yīng)差異的相關(guān)性也見于其他類型細(xì)胞的培養(yǎng)研究[25].目前，還未見高氧對(duì)3T3-L1前脂細(xì)胞影響的研究報(bào)道.在本研究中，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在30%O2條件下培養(yǎng)48 h后大量死亡，95%O2下培養(yǎng)48 h后幾乎無細(xì)胞存活；肝細(xì)胞系BRL和前脂細(xì)胞系3T3-L1在10%～ 95%O2條件下培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞數(shù)隨氧濃度增加而不斷減少.這與以往多種細(xì)胞的高氧培養(yǎng)研究結(jié)果一致，過高濃度氧的長時(shí)間暴露對(duì)細(xì)胞具有嚴(yán)重的損害和毒性作用.

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（編輯 王 ?。?