王銳，楊浩*

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

平滑處理和掃描范圍對多孔膜原子力顯微鏡分析的影響

王銳，楊浩*

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

原子力顯微鏡（AFM）能獲得材料表面形貌、三維圖、表面粗糙度等信息，是定量分析材料表面的主要工具之一.以自制的多孔膜為研究對象，通過對AFM圖像的平滑處理以及改變掃描范圍，系統(tǒng)研究了上述因素對多孔膜孔深和表面粗糙度參數(shù)測量的影響.結(jié)果表明，多孔膜的AFM圖像經(jīng)平滑處理后局部會發(fā)生扭曲，多孔部分與膜之間的界限變得模糊，使孔深測量偏差較大，不能完全反映膜的表面微觀結(jié)構(gòu).當(dāng)掃描范圍較小時（≤2 μm×2 μm），孔深和表面粗糙度參數(shù)測量的相對誤差較小，而不同掃描范圍下得到的表面粗糙度參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差有較大差異.最大高度和最大孔深的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到了25%以上，平均粗糙度和均方根粗糙度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%左右，而平均最大孔深的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.5%.

原子力顯微鏡；平滑處理；掃描范圍；多孔膜；表面粗糙度

0 引言

原子力顯微鏡（AFM）是材料表面分析的強(qiáng)有力的工具.它的檢測范圍很廣，可以分析生物細(xì)胞［1－2］、膜材料［3－4］和納米顆粒［5］.由于AFM分辨率極高，能達(dá)到原子級別，人們還可以利用AFM來觀測多肽［6］、生物小分子［7］和氫鍵的形成［8］.此外，由于AFM的工作原理不同于常見的電子顯微鏡，它不僅可以分析材料的表面形貌和粗糙度［9］，還可以檢測材料的力學(xué)性能［10］，因此AFM在材料的分析和檢測中起到越來越重要的作用.

近年來，人們已利用AFM來分析不同材料的表面形貌和粗糙度，例如，碳纖維［11］、人工晶體生物材料［12］、牙齒復(fù)合材料［13］、糞鏈球菌生物膜［14］和人體血紅球膜［15］.然而，AFM在測量的準(zhǔn)確度上存在一些限制［16］，并有研究發(fā)現(xiàn)掃描分辨率、掃描速率、反饋控制參數(shù)、探針材料及其半徑對粗糙度測量具有一定的影響［17－20］.同時，人們也發(fā)現(xiàn)采用不同的掃描范圍得到的材料機(jī)械性能和粗糙度的數(shù)值會有所不同［21－22］，需要通過數(shù)據(jù)處理來矯正這種掃描范圍的依賴性［23］，但這些結(jié)果都是在特定的系統(tǒng)中得到的，不具有普適性.因此，要準(zhǔn)確測量材料的表面粗糙度需要針對特定的形貌，并了解和掌握不同參數(shù)對其測量結(jié)果的影響.

本研究以自制的殼聚糖多孔膜為模型，通過改變AFM掃描范圍并對圖像進(jìn)行平滑處理，探討以上因素對表面形貌、孔深和表面粗糙度參數(shù)測量的影響.研究隨機(jī)選取了三個孔作為研究對象，通過AFM圖像和截面分析（section analysis）來研究平滑處理和掃描范圍對表面形貌和孔深測量精度的影響，然后通過AFM的粗糙度分析（roughness analysis）功能統(tǒng)計不同掃描范圍下多孔膜粗糙度參數(shù)，并分析它們的相對偏差.有關(guān)AFM表面粗糙度參數(shù)見表1.

表1 AFM表面粗糙度的相關(guān)參數(shù)Table 1 The definitions of AFM surface roughness parameters

1 實驗部分

1.1 殼聚糖多孔膜的制備

殼聚糖多孔膜的制備工藝：將1．5 g殼聚糖與1．5 g PEG溶解在100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的醋酸溶液中，在此溶液中加入0．3 mL的戊二醛并不斷攪拌，靜置脫泡后將鑄模液倒入玻璃皿中，然后放入烘箱在40℃烘干12 h.將干燥后的膜放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液中浸泡30 min中和多余的醋酸，之后再用去離子水沖洗除去OH－，再將膜放在90℃熱水浴中抽取10 h.熱水處理不僅可以溶解膜中的PEG，得到多孔結(jié)構(gòu)，還可以改善膜的機(jī)械性能.將抽取后的膜固定在玻璃皿上，用濾紙吸干后自然晾干即可得到殼聚糖多孔膜.

1.2 原子力顯微鏡表征

采用美國Veeco公司生產(chǎn)的Multi－Mode型原子力顯微鏡對多孔膜進(jìn)行測量.掃描采用RTESP型硅探針（Veeco），采用輕敲模式在空氣中進(jìn)行測量，掃描頻率為1 Hz，分辨率為256×256，掃描范圍分別為10 μm×10 μm、5 μm×5 μm、2 μm×2 μm和1 μm×1 μm.

圖像數(shù)據(jù)的采集及分析用該儀器配置的軟件（v5．31r1）進(jìn)行處理.圖像的平滑處理為3級平滑處理.樣品表面的粗糙度參數(shù)是通過軟件的粗糙度分析功能對整個AFM圖像直接計算得到的.

2 結(jié)果與討論

2.1 平滑處理對多孔膜孔深測量的影響

當(dāng)光滑的表面偶爾出現(xiàn)較高的特征峰時，我們通常會采用平滑處理的方式以去除圖像中出現(xiàn)的掃描線，得到清晰的AFM圖像.但目前為止還沒有研究報道AFM圖像平滑處理對膜表面分析的影響.

圖1是多孔膜的原始AFM圖.從圖中可知，樣品表面存在著很多大小不一的多孔結(jié)構(gòu).當(dāng)掃描范圍≥5 μm×5 μm時，所得到的AFM圖像高低不平，特別是當(dāng)掃描范圍達(dá)到10 μm×10 μm時出現(xiàn)了較大的起伏，如圖a中間部分出現(xiàn)了明顯的凹陷；而當(dāng)掃描范圍≤2 μm×2 μm時，可知膜的表面比較平整，沒有明顯的凸起，多孔部分與平整部分對比度明顯，圖像清晰（圖c，d）.

圖1 掃描范圍分別為10μm×10μm（a1－a4），5μm×5μm（b1－b4），2μm×2μm（c1－c4）和1μm×1μm（d1－d4）的多孔膜原始AFM圖Fig.1 Pristine AFM images of porous film under different scan size：10 μm×10 μm（a1－a4），5 μm×5 μm（b1－b4），2 μm×2 μm（c1－c4）and 1μm×1 μm（d1－d4）

圖2 平滑處理后掃描范圍分別為10 μm×10 μm（a1－a4），5 μm×5 μm（b1－b4），2 m×2 m（c1－c4）和1μm×1μm（d1－d4）的多孔膜AFM圖Fig.2 Flattening AFM images of porous film under different scan size：10 μm×10 μm（a1－a4），5 μm×5 μm（b1－b4），2 μm×2 μm（c1－c4）and 1μm×1 μm（d1－d4）

表2 孔Ⅰ、孔Ⅱ和孔Ⅲ的深度及偏差分析Table 2 The depths and deviation analyses of pore I,poreⅡand poreⅢ

從倒置的三維立體圖可進(jìn)一步知多孔結(jié)構(gòu)在膜下面的分布情況，也可知不同掃描范圍下多孔結(jié)構(gòu)與膜之間過渡較平滑，沒有出現(xiàn)明顯的圖像扭曲，即使在較大的掃描范圍下，圖像的起伏是整體的波動，局部上仍然是平整的.

圖2是經(jīng)過平滑處理后多孔膜的AFM圖.通過與圖1比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)平滑處理后，當(dāng)掃描范圍≥5 μm×5 μm時，原來整體出現(xiàn)起伏的圖像變得較平整，如圖a，b.但當(dāng)掃描范圍≤2 μm×2 μm時，原來平整的表面出現(xiàn)了起伏，特別是當(dāng)掃描范圍只有1 μm×1 μm時，多孔結(jié)構(gòu)之間的區(qū)域出現(xiàn)了明顯的凸起，如圖d所示.從三維圖和倒置的三維圖可知，平滑處理后多孔結(jié)構(gòu)與膜之間的對比度降低，界限變得模糊（圖d2，d3），且膜的局部出現(xiàn)了更多起伏，說明平滑處理對AFM圖像產(chǎn)生了一定的扭曲.

為了進(jìn)一步研究平滑處理對孔深測量的影響，采用截面分析（section analysis）在同一條線上選取了3個孔，分別記為孔Ⅰ、孔Ⅱ和孔Ⅲ（如圖1（d1）和圖2（d1）），并分別得到平滑處理前后不同掃描范圍下三個孔的截面分析圖（圖1，2第四欄）.從截面分析圖中可以得到多孔膜在垂直方向上的波動曲線，從而測得不同孔的深度，其結(jié)果列于表2.

通過對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行偏差分析可得到平滑處理前后對孔深測量精確度的影響.從表2數(shù)據(jù)分析可知，孔Ⅰ、孔Ⅱ和孔Ⅲ經(jīng)過平滑處理后的孔深平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差均要大于平滑處理前的，如孔Ⅲ平滑處理后孔深的標(biāo)準(zhǔn)偏差為處理前的3．85倍，說明平滑處理導(dǎo)致了孔深測量精確度的降低.這是因為對AFM圖像進(jìn)行平滑處理會將像素與周邊像素做加權(quán)平均，使得數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定的偏差.因此，為了減小測量誤差，得到真實的多孔膜表面的粗糙度參數(shù)，本實驗后期所討論的粗糙度參數(shù)均是在原始的AFM圖像中得到的.

2.2 掃描范圍對多孔膜粗糙度參數(shù)測量的影響

在相同掃描頻率下改變掃描范圍會改變探針的移動速率，從而導(dǎo)致AFM圖像的差異.我們對原始的AFM圖像（圖1）在不同掃描范圍下得到的孔深的相對誤差進(jìn)行分析，得到表3.從表3可知，孔Ⅰ、孔Ⅱ和孔Ⅲ的深度的相對誤差隨著掃描范圍的減小有明顯的降低趨勢，但相對誤差并不完全隨著掃描范圍的減小而降低.當(dāng)掃描范圍降至2 μm×2 μm以下時，相對誤差產(chǎn)生了不確定的變化趨勢，有的變大（如孔Ⅱ和孔Ⅲ），有的變?。ㄈ缈注瘢?，但總體上相對誤差較小，在3%左右波動.因此，掃描范圍在2 μm×2 μm及以下時所測的孔深相對誤差較小.

表3 不同掃描范圍下孔深的相對誤差（原始AFM圖）Table 3 The relative errors of pore depths under variant scan sizes（for pristine AFM images）

表4 不同掃描范圍下表面粗糙度參數(shù)（原始AFM圖）Table 4 Surface roughness parameters under variant scan sizes（for pristine AFM images）

以上分析只是針對個別孔洞進(jìn)行的，不能代表多孔膜整體的粗糙度，因此我們對不同掃描范圍下的AFM圖像進(jìn)行粗糙度分析（roughness analysis），得到統(tǒng)計學(xué)意義上的表面粗糙度參數(shù)，見表4.

由表4可知，掃描范圍對不同表面粗糙度參數(shù)的影響不同.其中，最大高度和最大孔深影響最大，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到了25%以上，而平均粗糙度和均方根粗糙度影響居中，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%左右，影響最小的是平均最大孔深，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3．5%.這說明在測量多孔膜表面粗糙度時，要考慮各種粗糙度參數(shù)對掃描范圍的依賴性，從實驗結(jié)果可知，平均最大孔深的結(jié)果是不依賴掃描范圍的，而平均粗糙度和最大高度等參數(shù)的測量最好是在同一掃描范圍內(nèi)進(jìn)行.此外，從表4還可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)掃描范圍較小時（≤2 μm×2 μm），各表面粗糙度參數(shù)在數(shù)值上較接近，因此，適當(dāng)減小掃描范圍有利于粗糙度參數(shù)測量精確度的提高.

3 結(jié)語

a.在較大的掃描范圍下，AFM圖像會發(fā)生整體的波動，但局部上仍然是平整的；

b.平滑處理后多孔結(jié)構(gòu)與膜之間的對比度降低，界限變得模糊，且膜的局部出現(xiàn)了更多起伏，說明平滑處理對AFM圖像產(chǎn)生了一定的扭曲；

c.孔深的相對誤差隨著掃描范圍的減小有明顯的降低趨勢，且當(dāng)掃描范圍在2 μm×2 μm及以下時所測的孔深相對誤差較小；

d.經(jīng)過平滑處理后的孔深平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差均要大于平滑處理前的，說明平滑處理導(dǎo)致了孔深測量精確度的降低；

e.不同表面粗糙度參數(shù)對掃描范圍的依賴性不同：最大高度和最大孔深依賴性最大，平均粗糙度和均方根粗糙度依賴性居中，而平均最大孔深幾乎不存在依賴性.可通過適當(dāng)減小掃描范圍提高粗糙度參數(shù)測量的精確度.

致謝

感謝國家自然科學(xué)基金委員會，湖北省教育廳和武漢工程大學(xué)團(tuán)委的資助.

［1］MULLER D J，DUFRENE Y F．Atomic force microscopy：a nanoscopic window on the cell surface［J］．Trends Cell Biol，2011，21（8）：461－469．

［2］楊浩，宋濤，趙慧平，等．大腸桿菌在原子力顯微鏡下的觀測及其形貌［J］．武漢工程大學(xué)學(xué)報，2012，34（12）：8－12．

YANG Hao，SONG Tao，ZHAO Hui－ping，et al．I-maing and morphology of Escherichia coli using atomic force microscopy［J］．J Wuhan Inst Tech，2012，34（12）：8－12．（in Chinese）

［3］WONG P C Y，KWON Y N，CRIDDLE C S．Use of atomic force microscopy and fractal geometry to characterize the roughness of nano－，micro－，and ultrafiltration membranes［J］．J Membr Sci，2009，340（1－2）：117－132．

［4］江川，汪建華，熊禮威，等．基片溫度對納米金剛石薄膜制備的影響［J］．武漢工程大學(xué)學(xué)報，2012，34（4）：39－42．

JIANG Chun，WANG Jian－h(huán)ua，XIONG Li－wei，et al．Influence of substrate temperature on preparation of nano－crystalline diamond films［J］．J Wuhan Inst Tech，2012，34（4）：39－42．（in Chinese）

［5］HOO C M，STAROSTIN N，WEST P，et al．A comparison of atomic force microscopy（AFM）and dynamic light scattering（DLS）methods tocharacterize nanoparticle size distributions［J］．J Nanopart Res，2008（10）：89－96．

［6］ZHANG S，ANDREASEN M，NIELSEN J T，et al．Coexistence of ribbon and helical fibrils originating from hIAPP（20－29）revealed by quantitative nanomechanical atomic force microscopy［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（8）：2798－2803．

［7］KATAN A J，DEKKER C．High－speed AFM reveals the dynamics of single biomolecules at the nanometer scale［J］．Cell，2011，147（5）：979－982．

［8］ZHANG J，CHEN P C，YUAN B K，et al．Real－space identification of intermolecular bonding with atomic force microscopy［J］．Science，2013，342（6158）：611－614．

［9］KAVEI G，ZARE Y，GHEIDARI A M．Evaluation of surface roughness and nanostructure of indium tin oxide（ITO）films by atomic force microscopy［J］．Scanning，2008，30（3）：232－239．

［10］ZHANG W，STACK A G，CHEN Y S．Interaction force measurement between E．coli cells and nanoparticles immobilized surfaces by using AFM［J］．Colloids Surf B－Biointerfaces，2011，82（2）：316－324．

［11］JAGER J，MOOSBURGER－WILL J，HORN S．Determination of nano－roughness of carbon fibers by atomic force microscopy［J］．J Mater Sci，2013，48（19）：6803－6810．

［12］MUKHERJEE R，CHAUDHURY K，DAS S，et al．Posterior capsular opacification and intraocular lens surface micro－roughness characteristics：An atomic force microscopy study［J］．Micron，2012，43（9）：937－947．

［13］DA SILVA M A B，F(xiàn)ARDIN A B，de Vasconcellos R C C，et al．Analysis of roughness and surface hardness of a dental composite using atomic force microscopy and microhardness testing［J］．Microsc Microanal，2011，17（3）：446－451．

［14］SANTOS R P，ARRUDA T T P，CARVALHO C B M，et al．Correlation between Enterococcus faecalis biofilms development stage and quantitative surface roughness using atomic force microscopy［J］．Microsc Microanal，2008，14（2）：150－158．

［15］GIRASOLE M，POMPEO G，CRICENTI A，et al．The how，when，and why of the aging signals appearing on the human erythrocyte membrane：an atomic force microscopystudyofsurfaceroughness［J］．Nanomedicine－Nanotechnology Biology and Medicine，2010，6（6）：760－768．

［16］EVES B J，GREEN R G．Limitations on accurate shape determination using amplitude modulation atomic force microscopy［J］．Ultramicroscopy，2012，115：14－20．

［17］HRISTU R，STANCIU S G，STANCIU G A，et al．Influence of atomic force microscopy acquisition parameters on thin film roughness analysis［J］．MicroscRes Tech，2012，75（7）：921－927．

［18］WANG C M，ITOH H．Evaluation of errors in the measurement of surface roughness at high spatial frequency by atomic force microscopy on a thin film［J］．Jpn J Appl Phys，2012，51（8）：08KB11-08KB11-5．

［19］李家文，陳宇航，黃文浩．AFM掃描參數(shù)對表面粗糙度測量的影響分析［J］．電子顯微學(xué)報，2007，26（1）：32－35．

LI Jia－wen，CHEN Yu－h(huán)ang，HUANG Wen－h(huán)ao．Study on the scanning parameters affecting surface roughness measurements by AFM［J］．J Chin Electr Microsc Soc，2007，26（1）：32－35．（in Chinese）

［20］王子儀，張榮君，鄭玉祥，等．AFM掃描參數(shù)對樣品粗糙度測量的影響［J］．實驗室研究與探索，2013，32（2）：5－7．

WANG Zi－yi，ZHANG Rong－jun，ZHENG Yu－xiang，et al．Influence of AFM scanning prarameters on surface roughness measurement［J］．Res Explor Lab，2013，32（2）：5－7．（in Chinese）

［21］LOPARIC M，WIRZ D，DANIELS A U，et al．Micro－and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation－type atomic force microscopy：Validation with a gel－microfiber composite［J］．Biophys J，2010，98（11）：2731－2740．

［22］MENDEZ－VILAS A，BRUQUE J M，GONZALEZMARTIN M L．Sensitivity of surface roughness parameters to changes in the density of scanning points in multi－scale AFM studies．Application to a biomaterial surface［J］．Ultramicroscopy，2007，107（8）：617－625．

［23］ANTONIO P D，LASALVIA M，PERNA G，et al．Scale－independent roughness value of cell membranes studied by means of AFM technique［J］．Biochim Biophys Acta－Biomembr，2012，1818（12）：3141－3148．

Influence of flattening and scan size on surface analysis of porous film using atomic force microscopy

WANG Rui，YANG Hao
School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

Atomic force microscopy（AFM）is one of the powerful instruments which can acquire information about surface morphology，three－dimensional（3D）image and surface roughness of materials．Taking homemade chitosan porous film as the research object，the influences of scan size and flattening of the AFM image on the measurement of morphology，pore depth and surface roughness parameters were systematically studied．The results show that AFM images，which are locally smooth，fluctuate overall at larger scan size．Besides，AFM images distort partially after they have been flatten，and the boundaries between the pore and the film become blurry，which enlarges the deviation of the measured pore depth and obscures the real surface microstructures．The relative errors of the pore depth decrease dramatically with the reduction of the scan size，and they are smaller at minor scan sizes of≤2 μm×2 μm．Meanwhile，flattening the AFM images decreases the accuracy of the pore depth．With regard to various surface roughness parameters，their relative standard deviations show significant differences under variant scan sizes．The relative standard deviation of max high and max peak is over 25%，and that of mean roughness and root mean square roughness is about 15%．Nevertheless，the relative standard deviation of average max depth is less than 3．5%．

atomic force microscopy；flattening；scan size；porous film；surface roughness

O04－34；TH742.9

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.07.008

1674－2869（2015）07－0034－06

本文編輯：張瑞

2015－05－05

國家自然科學(xué)基金項目（21201135）；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計劃中青年人才項目（Q20121502）；武漢工程大學(xué)第九期大學(xué)生校長基金（2014019）

王銳（1993－），男，湖北天門人，本科．研究方向：功能界面材料．*通信聯(lián)系人