王　瑩　王菊英　穆景利

(國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室　大連　116023)

隨著石油開采和海洋運輸業(yè)的發(fā)展, 每年都有大量的石油由于各種溢油事故進入海洋環(huán)境(Vinaset al, 2009), 海洋石油污染已經成為全球關注的熱點問題。由于溢油多屬突發(fā)性事故, 因此一旦發(fā)生溢油,石油必將大量流入海洋, 影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能。石油的組分十分復雜, 并且石油在進入海洋環(huán)境后, 會發(fā)生風化過程, 生成許多新的物質(Mallakinet al, 2000; Lundstedtet al, 2007; Tsapakis and Stephanou 2007; Haritash and Kaushik 2009; 曹磊等, 2013)。而現有的溢油災后處置及溢油修復技術主要通過評價石油烴、總烷烴或總芳烴的降價率來評價降解效果(鄭立等, 2012), 具體哪些溢油毒性組分應作為重點關注的對生物體產生不利影響的污染物還不明確。因此, 開展溢油特征污染物的甄選工作, 有助于闡明溢油對生態(tài)環(huán)境的長期影響, 同時也有助于有針對性地發(fā)展各種溢油污染修復技術(Garrettet al, 1998)。

毋庸置疑, 發(fā)展基于計算機的預測毒理學工具來代替整體動物實驗測試, 可以促進污染物生態(tài)風險評價的發(fā)展。因此, 采用模型預測的方式增補實驗數據, 可以降低昂貴的測試費用, 減少動物實驗, 符合化學品風險管理中關于縮減動物實驗的“3R”原則(陳景文等, 2008; Wangetal, 2009a)。定量結構-活性相關模型(QSAR)可以用于預測有機污染物的生態(tài)毒理學效應。由于溢油及其風化產物的組分復雜性, 因此可以通過構建QSAR模型對溢油主要污染物的生態(tài)風險進行定量評估、對溢油中的主要毒性物質進行甄別。本文結合美國溢油事件中的主要污染物分類方法,根據溢油事故的潛在特征污染物名單和持久性、生物富集性和毒性(PBT)判別結果, 應用基于密度泛函理論(DFT)參數的QSAR模型, 嘗試性篩選出溢油事故的特征污染物名單, 為海洋環(huán)境管理部門在溢油污染物監(jiān)管和控制等方面提供參考。

1　研究方法

首先對潛在特征污染物PBT判別結果進行初篩。再對 PBT類污染物進行毒性數據收集和篩選, 構建基于DFT參數的QSAR模型, 并對QSAR模型進行驗證和表征。最后, 嘗試性提出特征污染物名單。

在環(huán)境科學中, QSAR是一種定量表征有機污染物的分子結構與其理化性質、環(huán)境行為和生態(tài)毒理學性質之間關系的預測模型。起初, QSAR主要應用于化學和藥物學領域, 尤其在藥學研究中發(fā)揮重要作用。隨著進入到環(huán)境中的有機污染物日益增多, 為滿足生態(tài)風險評價的需要, QSAR開始被應用于環(huán)境科學領域。在溢油毒性組分進入昂貴、費時的實驗室待測階段之前, 本研究嘗試應用QSAR方法實現對溢油中毒性特征污染物進行快速篩選。

1.1　特征污染物初篩方法

本研究采用US EPA與美國SRC公司聯(lián)合開發(fā)的EPI Suite V4.0軟件對特征污染物進行PBT判別。表1給出了我國 PBT類化合物判別標準(中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 2009)。在使用 EPI SUTITE軟件對化學物質持久性的篩選標準為滿足以下條件之一: (1)Biowin 2和Biowin 3; 不能快速降解(概率＜0.5)及最終生物降解時間預測值＜2.2; (2) Biowin 6和 Biowin 3; 不能快速降解(概率＜0.5)及最終生物降解時間預測值＜2.2。在使用EPISuite軟件時, 優(yōu)先選取參數的實驗值, 若無實驗值則采用EPI SUTITE軟件估算值。

表1　我國PBT類化合物判別標準Tab.1　Acceptance and rejection criteria for Chinese PBT chemicals

1.2　量子化學參數的獲取

生物體內的化合物的濃度有助于評價其毒性作用機制(Wangetal, 2009b)。分子之間的相互作用是決定化合物在水相和生物相之間分配的決定因素。因此,選取摩爾分子體積(V)和分子平均極化率(α)作為描述符表征化合物在兩相之間的分配作用。此外, 最高占據軌道能(EHOMO)表征分子受親電試劑進攻的難易程度, 最低未占據軌道能(ELUMO)表征分子與親核試劑反應的難易程度。此外,EHOMO和ELUMO的能級差(EGAP)是表征分子穩(wěn)定性的一個重要指數。較大的能量差意味著分子穩(wěn)定性好, 即在化學反應中具有低的反應活性。

電負性指數ω, 可以表征化合物接受電子的能力。由下式計算:

其中,μ是化合物的化學勢,η是化合物的化學硬度。

表2給出了選取的兩類DFT參數: (1)描述在水相和脂肪相之間的分配(包括V和α), (2)描述化學穩(wěn)定性和接受電子能力參數(包括ELUMO,EHOMO,EGAP和ω)。

表2　分子結構參數Tabl.2　Molecular structural parameters

1.3　量子化學計算方法

利用Gaussian 09軟件中的DFT進行量子化學計算(Frischet al, 2009), 對優(yōu)化好的幾何構型進行頻率分析, 以確保體系無虛頻。計算的參數包括極化率、摩爾分子體積、前線分子軌道能、電負性指數。首先利用PM3算法對PAHs及其衍生物以及PAHs的中性分子和進行預優(yōu)化, 然后再利用DFT中的B3LYP方法在 6-31G(d, p)(Leeetal, 1988; Beckeetal, 2005)基組水平進行優(yōu)化, 獲得其穩(wěn)定構型后進行單點能計算。對優(yōu)化好的幾何構型進行頻率分析, 以確保體系無虛頻。根據頻率分析的結果計算極化率。

1.4　QSAR模型建立和交叉驗證

選取Bose等人(1998)測定的PAHs及其甲基化衍生物對海洋端足類生物的急性毒性數據, 采用半數效應濃度(EC50)的對數作為QSAR研究中的因變量。本研究使用了偏最小二乘(PLS)回歸分析方法建立模型。應用SIMCA軟件(Version 6.0, Umetri AB &Erisoft AB)進行 PLS回歸分析, 采用去多法交叉驗證(Hall,1998)。

2　溢油特征污染物篩選流程

2.1　溢油事故潛在特征污染物名單的確定

石油的組分十分復雜, 主要由烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴組成, 其余為膠質、瀝青質等。表3給出了不同類型油品各組分的特性和含量, 其毒性大小與烴類化合物的類別以及石油類別的不同而不同。從表3可以看出, 飽和烴類化合物容易生物降解, 且對水生生物毒性低; 極性化合物雖然難以生物降解, 但水溶解度和水生生物毒性很低。因此, 在溢油事件中對飽和烴類化合物和極性化合物一般不予關注。相對其他組分而言, 芳香烴具有相對較高的水溶解性和水生生物毒性風險(Ruthetal, 2002)。因此, BTEX類化合物(苯、甲苯、乙苯和鄰、間、對二甲苯)和多環(huán)芳烴(PAHs)是溢油事故中影響海洋環(huán)境的主要污染因子。PAHs中的烷基衍生物占到了原油中PAHs總量的80%—90%(Wangetal, 2003), 是指PAHs的分子結構中包含取代的烷基基團, 如甲基、乙基、異丙基等。

表3　石油組分及其特性Tab.3　Oil components and their chemical properties

石油烴中的PAHs在環(huán)境中通過生物轉化、光氧化等風化過程會生成PAHs的各種氧化衍生物, 同時,還會生成PAHs的其他各類衍生物, 包括PAHs羥基化衍生物以及芳香環(huán)開裂的產物, 如醛類以及羧酸類物質等(Garrettetal, 1998; Mallakinetal, 2000;Watsonet al, 2002; Maoet al, 2009), oxy-PAHs的分子結構可能還包括其他的一些官能團, 如烷基和羥基等。在諸多的PAHs環(huán)境轉化衍生物中, oxy-PAHs可能對生態(tài)環(huán)境的威脅更為嚴重。其中一個重要的原因是, oxy-PAHs比其他PAHs在環(huán)境中的轉化產物更具持久性, oxy-PAHs通常被稱為PAHs生物和化學降解過程中的“末端產物”, 而其他類別的 PAHs環(huán)境轉化衍生物則通常為“中間產物”。

因此, 根據石油及相關組分對水生生物及人體的毒性, 結合美國溢油事件中的主要污染物分類方法, 初步篩選出的溢油事故中的特征污染物為苯系物(BTEX)、多環(huán)芳烴及其烷基化和氧化衍生物。表4給出了溢油事故的42種初篩潛在溢油事故特征污染物名單。

2.2　潛在溢油特征污染物的PBT類物質篩選

在對特征污染物進行初篩的階段可使用一些比較保守的模型或數據從而加快速度。近年來隨著化學品環(huán)境管理技術的增強和人們對環(huán)境質量要求的不斷提高, 一類具有持久性(persistent)、生物蓄積性(bioaccumulative)和毒性(toxic)化學物質(統(tǒng)稱為 PBT物質)日益成為化學品環(huán)境管理關注的焦點。由于PBT物質可在環(huán)境中長期存留且在全球范圍擴散,同時沿著食物鏈能流傳遞并富集, 對高營養(yǎng)級生物產生致癌性、致畸性、內分泌干擾性、生殖毒性、免疫毒性等多種危害, 成為對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康具有特定風險的化學品; 另一方面是由于 PBT物質暴露具有低劑量、長時期和潛在性的特征, 其致毒與暴露之間的關系往往難以預測, 常規(guī)的試驗/檢測方法也無法快速有效地確認PBT在環(huán)境中的閾值。

本研究中, 對初步篩選的溢油事故中的 42種潛在特征污染物應用現有的實驗數據和 QSAR模型進行第二步的 PBT類物質篩選。鑒于 PBT物質環(huán)境危害的嚴重性和特殊性, 歐盟REACH法規(guī)和美國《有毒物質控制法》(TSCA)均已將PBT物質作為重要的管理對象, 我國等同轉化了REACH法規(guī)的相關技術內容, 見GB/T24782-2009《持久性、生物累積性和毒性物質及高持久性和高生物累積性物質的判定方法》, 我國的PBT類化合物判別標準見表1。表4給出了42種溢油事故中的初篩潛在特征污染物QSAR模型生物降解性、生物富集性和毒性預測結果。

表4　初篩的潛在溢油特征污染物生物降解性、生物富集性和毒性預測結果Tab.4　Predictive results of biological degradation, bio-concentration and toxicity for the preliminary potential characteristic pollutants in oil spill accidents

根據溢油事故的初次篩選潛在特征污染物名單的PBT判別結果, 結合美國溢油事件中的主要污染物分類方法, 得到溢油事故的 25種二次篩選特征污染物名單(滿足P、B、T中任一條件即可), 包括三類物質, 即: 12種PAHs、8種烷基化PAHs及5種PAHs氧化衍生物。雖然BTEX類化合物對人體健康和環(huán)境安全危害較大, 鑒于其對水生生物的毒性較低, 且為非持久性和生物富集性類物質, 高揮發(fā)性又會使其在環(huán)境中的暴露濃度迅速降低, 在環(huán)境中留存的時間較短。因此, 二次篩選的特征污染物過程中將其排除。

2.3　應用DFT及QSAR方法篩選溢油事故特征污染物

隨著QSAR技術的發(fā)展和應用, 量子化學參數更易于解釋毒性機理、篩選影響化合物毒性大小的主要分子結構因素。然而, 目前關于影響溢油主要組分毒性的分子結構因素方面的研究還十分缺乏, 直接影響溢油對海洋生態(tài)系統(tǒng)長期生態(tài)風險的評估。因此,基于量子化學參數構建QSAR模型, 對溢油中的主要毒性物質進行更深層次的篩選和甄別, 并揭示溢油毒性作用機制。

6種PAHs及其烷基化類化合物對端足類生物的急性毒性的QSAR方程如下:

式中n代表預測變量的數目,A代表 PLS主成分數,Q2CUM代表所有PLS主成分所能解釋因變量總方差的比例,R2代表擬合值和實測值的復相關系數, RMSE代表均方根誤差,P為統(tǒng)計分析時的概率值。表5給出了12種PAHs及其衍生物的分子結構參數值、EC50實驗/預測值和在水中的溶解度。

圖1給出了PAHs及其烷基化類化合物對端足類生物毒性的實測值和預測值的擬合圖?？梢钥闯? 模型的預測值與實測值比較接近, 具有較好的擬合效果(R2=0.97, RMSE =0.079)和穩(wěn)健性(交叉驗證Q2CUM=0.97)。

表5　PAHs及其衍生物的分子結構參數值、EC50實驗/預測值和溶解度Tab.5　Molecular structural parameters, experimental and predictive EC50 values, and water solubility for PAHs and their derivatives

為了考察預測變量對模型的影響, 表6分別給出了模型的變量投影重要性(VIP)值和PLS主成分載荷(W*[1] 和W*[2])。在QSAR方程中,V和α的VIP值最大, 且顯著高于ELUMO, 表明,V和α對方程的解釋能力大于其他描述符。根據各個自變量在某個 PLS主成分的載荷值可以看出各個自變量對該主成分的貢獻大小。模型中變量V和α在第一個主成分上的載荷較高, 主要濃縮分子間作用力信息。負的回歸系數和負PLS主成分載荷表明V和α與logEC50之間呈現負相關關系。

構建的PAHs及其衍生物的QSAR模型可以用于進一步解釋化合物對水生生物的毒性作用機理。QSAR模型結果表明極化率α是影響PAHs毒性的最主要分子結構參數。PAHs屬于非極性或弱極性化合物, 易于在非極性環(huán)境中, 如: 細胞膜中的磷脂(其脂肪酸鏈具有非極性特性)中分配(Newstedetal, 1987)。分配作用取決于分子間作用力的強弱, 而分子間力最重要的是色散力?；衔锏纳⒘υ綇? 對于蒽醌類化合物以及PAHs越傾向在生物的細胞膜中分配。由于色散力與極化率的平方成正比, 因此, 對于 PAHs, 具有較大的極化率更易于在生物體內富集而產生毒性。還可以發(fā)現, 極化率也就是電子云的變形程度和分子體積呈現很好的相關性。

圖1　PAHs類化合物對端足類生物急性毒性(logEC50)的實驗值和預測值(化合物的序號見表5)Fig.1　Observed toxicity (logEC50) of PAHs versus their predictive toxicity to amphipoda(sequence numbers of PAHs are given in Tab.5)

表6　QSAR中的VIP值和PLS權重Tab.6　VIP values and PLS weight of Equation

基于溢油事故特征污染物二次篩選結果, 對溢油中的PAHs及其衍生物的分子結構參數進行計算, 表7給出了高斯計算得到的量子化學分子結構參數值。應用建立的QSAR模型, 對下述二次篩選的19種溢油污染物的毒性進行預測, 結果見表7。從表7可以看出,苊、菲、芘、熒蒽四種化合物的EC50預測值分別為:621nmol/L, 32nmol/L, 27nmol/L和32nmol/L而其實驗結果為“無法測定”, 即: 在其溶解度范圍內沒有表現出毒性效應, 因此, 設定入選溢油特征污染物的EC50臨界值為27nmol/L。

表7　溢油中PAHs及其衍生物的分子結構參數及EC50預測值Tab.7　Molecular structures and EC50 values of PAHs and their derivatives in oil spill incidence

2.4　溢油事故特征污染物篩選結果

生物有效性是指化學物穿過生物膜而進入細胞的可能性, 由于污染物的自由溶解態(tài)濃度能比總濃度更好地反映污染物的生物有效性, 因此溢油特征污染物的EC50還需小于其相應的在水中的溶解度。因此, 最終篩選出了溢油事故的 12種二次篩選特征污染物名單, 包括3種PAHs、8種烷基化PAHs及1種PAHs氧化衍生物, 即: 苯并[a]芘、二苯并(a,h)蒽、屈、2,3,6-三甲基萘、2-甲基蒽、1-甲基菲、3-甲基菲、9-甲基菲、1,7-二甲基菲、3,6-二甲基菲、7-異丙基-1-甲基菲和苯并蒽酮。

2.5　溢油事故特征污染物篩選方法分析

QSAR模型除了在有機污染物理化性質和生物活性預測中的基本應用之外, 近年來在污染物篩選方面也有進一步的應用和潛在前景(王斌等, 2007)。黃俊等(2003)按照持久性有機污染物(POPs)標準, 借鑒荷蘭 PBT篩選流程, 利用基于 QSAR的計算機輔助工具EPI篩選得到111種POPs嫌疑物質。而利用基于DFT理論的QSAR模型篩選原油毒性特征污染物工作還未見相關報道。本研究通過借鑒前人發(fā)展的PAHs的毒性QSARs模型(Ribeiroet al, 2005; Wanget al, 2009a), 構建了PAHs及其甲基化衍生物對海洋端足類生物毒性 QSAR模型, 并對溢油污染物(含風化產物)的毒性進行預測, 嘗試提出溢油事故需重點關注的上述 12種特征污染物。從當前的研究來看, 在溢油事故中關注的對象主要包括 US EPA優(yōu)控的 16種PAHs、烷基化取代PAHs及總石油烴含量(Honget al, 2012; 曹磊等, 2013; 張耀丹等, 2013)。而菲及烷基取代菲等PAHs標志物的診斷比值用于風化溢油的來源鑒別, PAHs標志物自身是否為重點關注的毒性組分還不明確。因此, 本研究應用QSAR模型等計算毒理學方法進行溢油毒性特征污染物篩選, 有望提高海洋環(huán)境管理部門對溢油污染物的監(jiān)管和控制能力, 同時也為優(yōu)先控制污染物的篩選提供新方法和新思路。

3　結論

本文結合美國溢油事件中的主要污染物分類方法, 針對溢油事故的潛在特征污染物進行 PBT判別,然后建立基于 DFT分子結構參數的 QSAR模型, 嘗試性篩選出溢油事故的 12種特征污染物, 包括 3種PAHs、8種烷基化PAHs及1種PAHs氧化衍生物。由于oxy-PAHs中的醌類化合物中特殊的羰基官能團,可能會導致其毒性預測結果具有較大的不確定性,需要進一步發(fā)展相應的QSAR模型。此外, 需要拓展QSAR模型中所采用的水生生物類型, 以進一步確認溢油事故特征污染物篩選的準確性和可靠性并及時進行特征污染物的名單動態(tài)調整。

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