樊蔚虹，禹 方，姚建平

(河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

柴胡疏肝散對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬調(diào)節(jié)HPA軸功能的影響*

樊蔚虹，禹 方，姚建平

(河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

目的:研究柴胡疏肝散對慢性應(yīng)激模型大鼠海馬調(diào)節(jié)HPA軸功能的影響。方法:采用慢性不可預(yù)見性刺激制造慢性應(yīng)激大鼠模型，分別用Western bolt法和Elisa法檢測各組大鼠海馬MR和GR及下丘腦CRH蛋白的表達(dá)，檢測血漿ACTH和血清CORT含量。結(jié)果:治療組大鼠海馬GR蛋白表達(dá)明顯增高，下丘腦CRH蛋白表達(dá)及血漿ACTH和血清CORT的含量明顯降低。結(jié)論:柴胡疏肝散能夠抑制慢性應(yīng)激所致的大鼠HPA軸功能的亢進(jìn)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠海馬GR蛋白表達(dá)、進(jìn)而發(fā)揮對HPA軸功能的抑制作用有關(guān)。

柴胡疏肝散;海馬;GR;MR;HPA軸

抑郁癥是一種嚴(yán)重危害人類身心健康的疾病。近年來，抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防及治療引起學(xué)者們越來越廣泛的關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)見性刺激制造抑郁大鼠模型，用疏肝解郁代表方柴胡疏肝散為治療方劑，從慢性應(yīng)激模型大鼠海馬調(diào)節(jié)HPA軸功能的角度探索抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和柴胡疏肝散的治療機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠，5～6月齡，體質(zhì)量(300± 20)g共30只，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:SCXK(豫)2010-0002)。大鼠普通飲食、自由飲水(造模時禁食、禁水應(yīng)激刺激除外)，室溫18～25℃(造模時冷應(yīng)激刺激除外)，相對濕度60% ～70%，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2 藥物

參照中國中醫(yī)藥出版社中《中醫(yī)方劑學(xué)》第七版教材中柴胡疏肝散:柴胡6 g，陳皮6 g，川芎4.5 g，香附4.5 g，枳殼4.5 g，白芍4.5 g，炙甘草1.5 g。均按原方比例熬制，使其終濃度為1 g/ml。

1.3 儀器與材料

蛋白垂直電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，圖像分析系統(tǒng)(北京天地公司)，酶標(biāo)儀:1510-00441C;GR、MR和CRH多克隆抗體及二抗(Santa cruz)，大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素ELISA試劑盒、大鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(美國R＆D)。

1.4 動物分組

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日觸摸大鼠2 min，以使大鼠能適應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為柴胡疏肝散組、抑郁模型組、正常對照組3組各10只。

1.5 抑郁模型制備

動物模型的制備采用經(jīng)典的慢性不可預(yù)見性應(yīng)激方法(chronic unpredictable stress，CUS)，根據(jù)文獻(xiàn)［1］做出部分修改。應(yīng)激包括冰水游泳(4℃，3 min)、熱水游泳(55℃，3 min)、束縛4 h、搖晃(每次3 min)、夾尾(每次15 s共3 min)、禁水24 h、禁食24 h、剝奪睡眠12 h共8種刺激，每日隨機(jī)選取1種刺激方法，使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以達(dá)到制備慢性應(yīng)激大鼠的目的。在整個實(shí)驗(yàn)中，每種刺激應(yīng)用1～3次。

1.6 給藥方法

柴胡疏肝散組大鼠按生藥量7.875 g/(kg·d)灌胃，相當(dāng)于成人(60 kg)臨床用量的15倍。從應(yīng)激刺激開始灌胃至應(yīng)激結(jié)束止，共用藥21 d。正常對照組及抑郁模型組給予同等劑量的生理鹽水。

1.7 Western-Blot法檢測海馬MR、GR和下丘腦CRH的蛋白表達(dá)

10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，用消毒手術(shù)器械取海馬及下丘腦，分置于高壓蒸汽滅菌的EP管中，100 mg組織中加入RIPA裂解液900 μL，冰浴勻漿，加入100 μL PMSF(0.1 μL)液，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中并加入40 μL complete(10 μg/μL)液，離心(4℃，10000 r/10 min)，取上清分裝，－70℃保存。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，各組樣品入沸水3～5 min變性，取等量樣品做SDS-PAGE凝膠電泳(電壓120V)。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(0.22 μm的NC膜，4℃，電壓100 V，轉(zhuǎn)膜3 h)。麗春紅預(yù)染NC膜，PBS洗凈，5%脫脂牛奶封閉1.5h，再將膜轉(zhuǎn)移至加有2 ml 1∶200稀釋的兔抗大鼠一抗雜交袋中，37℃搖床孵育3.5 h，PBST洗膜6×5 min，轉(zhuǎn)移至加有2ml 1∶5000稀釋的山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗雜交袋中，37℃搖床孵育1.5 h，PBST洗膜×5 min。加入化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)5 min，保鮮膜包裹，暗室X線膠片曝光、顯影和定影。Western blot條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理，計(jì)算各目的帶光密度值，將各組的光密度值與對照組比較，得到相對百分?jǐn)?shù)。

1.8 大鼠血液標(biāo)本采集及ACTH和CORT的測定

造模結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動脈采血(每只鼠均取抗凝、促凝2管血)，3000 r離心15 min，取血漿及血清分裝，－70℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行大鼠血漿ACTH和血清CORT含量的檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散對各組大鼠海馬GR和MR、下丘腦CRH蛋白表達(dá)的影響

表1顯示，與正常對照組比較，抑郁模型組大鼠海馬GR蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與模型組比較，柴胡疏肝散組大鼠海馬GR蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，各組間MR蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對照組比較，抑郁模型組大鼠下丘腦CRH蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05);與模型組比較，柴胡疏肝散組大鼠下丘腦CRH蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠海馬GR和MR、下丘腦CRH蛋白表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠海馬GR和MR、下丘腦CRH蛋白表達(dá)(±s)

注:與正常對照組比較:▲P＜0.05;與抑郁模型組比較:*P＜0.05

組 別 例數(shù) 劑量(g/kg/d) GR (OD值) MR (OD值) CRH (OD值)正常對照組 3 —0.647±0.061 0.482±0.015 23.933±0.222抑郁模型組 3 —— 0.404±0.003▲0.485±0.014 45.847±0.655▲柴胡疏肝散組 3 7.875 0.627±0.005* 0.473±0.009 34.292±0.315*

2.2 柴胡疏肝散對各組大鼠血漿ACTH與血清CORT含量的影響

表2顯示，與正常對照組比較，抑郁模型組大鼠血漿 ACTH與血清 CORT含量明顯增高(P＜0.05);與模型組比較，柴胡疏肝散組大鼠血漿ACTH與血清CORT含量明顯降低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血漿ACTH與血清CORT含量(±s)

表2 各組大鼠血漿ACTH與血清CORT含量(±s)

注:與正常對照組比較:▲P＜0.05;與抑郁模型組比較:*P＜0.05

組 別 例數(shù) 劑量(g/kg/d) ACTH(ng/ml) CORT(ng/ml)正常對照組 10 —22.341±1.882 8.664±0.604抑郁模型組 10 — 44.304±2.576▲13.945±0.880▲柴胡疏肝散組 10 7.875 29.185±2.367*10.195±0.541*

3 討論

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(CRH)作用于垂體，調(diào)控垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌，ACTH又可作用于腎上腺皮質(zhì)，影響HPA軸最終產(chǎn)物皮質(zhì)醇(哺乳動物為皮質(zhì)酮)的分泌，由此構(gòu)成了由上到下的順行調(diào)控。

近年來神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥發(fā)病常伴有下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能的改變。若機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，將嚴(yán)重影響其身心健康，使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥狀［2-3］。擬皮質(zhì)醇藥物能誘發(fā)抑郁，抗皮質(zhì)醇藥物能緩解抑郁癥，說明HPA軸功能亢進(jìn)可能與抑郁癥的發(fā)病過程相關(guān)。Watson等［4-5］在研究中發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦脊液(CSF)中CRH濃度增高，且經(jīng)過治療后，CSF中原先升高的CRH濃度比治療前有所降低，推測CSF中CRH濃度升高可能是抑郁癥的狀態(tài)標(biāo)志或是可以作為抑郁癥早期復(fù)發(fā)的預(yù)測因子。蔡莉［6］研究發(fā)現(xiàn)，CUMS模型大鼠下丘腦CRHmRNA表達(dá)顯著增高，表明抑郁模型大鼠存在CRH功能亢進(jìn)。另有研究證明［7-8］，動物和人類在抑郁狀態(tài)時血漿ACTH水平較高，且抑郁癥患者病情程度與血漿ACTH水平密切相關(guān)［9］，經(jīng)抗抑郁藥治療后血漿ACTH趨于正常化。CORT是HPA軸的終末激素，研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型小鼠血清CORT明顯高于正常對照組［10］。抑郁癥患者的血漿皮質(zhì)醇水平增加，尿游離皮質(zhì)醇排泄也增加［11］，抑郁緩解后皮質(zhì)醇的濃度下降［12］。

海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，為HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的重要組成部分［13］，糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在這一負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，慢性應(yīng)激模型大鼠海馬GRmRNA表達(dá)明顯下降［14-15］，抑郁癥患者存在GR數(shù)量的下降，造成糖皮質(zhì)激素對HPA軸負(fù)反饋?zhàn)饔玫臏p弱，使HPA軸功能更加亢進(jìn)，形成惡性循環(huán)［16-17］。劉麗琴［18］等研究也發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠海馬GRmRNA表達(dá)顯著降低，但各組間MRmRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

中醫(yī)無“抑郁癥”一名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，認(rèn)為它與“百合病”、“臟躁”、“梅核氣”等情志疾病相似，故將其命名為“郁證”。認(rèn)為郁證的發(fā)生多是由于情志所傷、肝氣郁結(jié)，逐漸引起五臟氣機(jī)失和所致，故治療應(yīng)以疏肝解郁為大法。大量研究顯示［19-21］，疏肝解郁法對抑郁癥時HPA軸功能亢進(jìn)有顯著調(diào)節(jié)作用。作為疏肝解郁的經(jīng)典方，柴胡疏肝散及其提取物均可拮抗慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的HPA軸功能亢進(jìn)，從而起到抗抑郁作用［22］。本實(shí)驗(yàn)中慢性應(yīng)激大鼠海馬GR蛋白表達(dá)明顯降低，下丘腦CRH表達(dá)及血漿ACTH、血清CORT含量水平明顯升高，提示在慢性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠海馬損傷對HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用減弱，HPA軸功能亢進(jìn)，釋放大量相關(guān)激素參與調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)，而過多的CRH、ACTH及CORT又進(jìn)一步破壞HPA軸的平衡。采用柴胡疏肝散對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散可明顯增加抑郁模型大鼠海馬GR蛋白的表達(dá)，降低抑郁模型大鼠下丘腦 CRH以及血漿ACTH、血清CORT水平。因此，通過海馬調(diào)節(jié)HPA軸功能亢進(jìn)可能是柴胡疏肝散治療抑郁癥的機(jī)制之一。

［1］Katz RJ，Roth KA，Carroll BJ.Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat:implications for a model of depression［J］.Neuro Biobehave Rev，1981，5:247-251.

［2］Holsboer F.Stress，hypercortisolism and corticosteroid receptors in depression:implications for therapy［J］.J Affect Disord，2001，62:77-91.

［3］陸汎，朱紅梅，謝俊杰，等.電針對抑郁癥大鼠行為學(xué)、血漿COR及海馬PKA、PKC表達(dá)的影響［J］.中國針灸，2008，28 (3):214-218.

［4］Watson S，Gallagher P，Ritchie J C，etal.Hypothalamic-pituitaryadrenal axis function in patients with hipolar disorder［J］.Br J Psychiatey，2004，184:496-502.

［5］Watson S，Gallagher P，Smith M S，etal.The dex/CRH test is it better than the DST［J］.Psycho-neuroendocrinology，2006，31: 889-894.

［6］蔡莉，李榮，吳清清，等.橙皮苷對慢性應(yīng)激模型大鼠行為學(xué)及HPA軸的影響［J］.中國中藥雜志，2013，38(2):229-233.

［7］金光亮，南睿，郭霞珍.慢性應(yīng)激肝郁大鼠模型的建立［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(2):18-21.

［8］唐萍，唐勝修，陳瓊英.抑郁癥患者治療前后皮質(zhì)醇和促皮質(zhì)醇激素的變化［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2004，26(7):1012.

［9］李琰琳，李琰珉，郭英，等.ACTH和皮質(zhì)醇對抑郁癥相關(guān)性研究［J］.淮坊醫(yī)學(xué)院校報(bào)，2009，31(3):213-214.

［10］管家齊，孫燕，陳海偉.百合地黃湯對小鼠抑郁癥模型的影響［J］.中華中醫(yī)中藥雜志，2013，28(6):1875-1877.

［11］李宏偉，高鎮(zhèn)松，吳強(qiáng)，等.抑郁障礙患者丘腦-垂體-腎上腺軸釋放功能與病情關(guān)系的研究［J］.黑龍江醫(yī)學(xué)，2011，35(11): 808-810.

［12］杜喆，韓芳，石玉秀.PTSD樣大鼠海馬MR和GR變化的研究［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16(6):695-700.

［13］Bender BG，Lerner JA，Ikle D，et al.Psychological change associated with theophylline of asthmatic children:a month study［J］.Pediater Pulmonol，1991，11(3):233-242.

［14］劉麗琴，羅艷，張瑞睿，等.人參皂苷對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)及HPA軸、BDNF的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36 (10):1342-1347.

［15］張晟，戴薇薇，張學(xué)禮，等.甘麥大棗湯加味對抑郁癥模型大鼠海馬-HPA軸的調(diào)節(jié)作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2012，32 (24):5450-5452.

［16］柴麗，趙博.抑郁癥與HPA軸關(guān)系及中藥干預(yù)的研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(12):268-271.

［17］陳淑媛，賀薇，石玉秀.海馬-HPA軸-PTSD的相關(guān)性［J］.中外醫(yī)療，2010，25:187-189.

［18］劉麗琴，羅艷，張瑞睿，等.人參皂苷對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及HPA軸、BDNF的影響［J］.中國中醫(yī)藥雜志，2011，36(10):1342-1347.

［19］李云輝，張春虎，王素娥，等.柴胡疏肝散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為及血漿腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和腎上腺皮質(zhì)激素的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7(11):1073-1077.

［20］史亞飛，嚴(yán)燦，吳麗麗，等.加味四逆散對束縛制動心理應(yīng)激大鼠HPA軸調(diào)節(jié)作用的影響［J］.中藥材，2008，31(1):88-91.

［21］丁杰，陳家旭，梁媛，等.逍遙散對肝郁脾虛證模型大鼠外周促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇的調(diào)節(jié)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(11):1436-1439.

［22］周鶯，裘曉紅，陳煜輝，等.柴胡疏肝散及其提取物對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦CRH含量的影響［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(3):58-59.

R749.4

B

1006-3250(2015)01-0050-03

2014-08-19

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃(2011GGJS-092)-柴胡疏肝散對抑郁癥大鼠海馬調(diào)控HPA軸作用機(jī)理研究

樊蔚虹(1957-)，女，安徽廬江人，教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事中醫(yī)常見證候的規(guī)范化研究。