耿雪冉，柳萬石，王賀祥**

（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2．金亨稷師范大學(xué)，朝鮮 平壤 999093）

污白干酪菌核糖核酸酶的分離純化和理化性質(zhì)*

耿雪冉1，柳萬石2，王賀祥1**

（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2．金亨稷師范大學(xué)，朝鮮 平壤 999093）

采用DEAE-cellulose陰離子交換層析、CM-cellulose陽(yáng)離子交換層析和FPLC-Superdex-75凝膠過濾層析，從污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）干子實(shí)體純化得到一種核糖核酸酶，SDS-PAGE電泳檢測(cè)其為單一蛋白，分子量為25 kDa。最適反應(yīng)條件為60℃，pH4．4。該酶對(duì)幾種寡聚核糖核苷酸的水解活性低于對(duì)t-RNA的水解活性。

污白干酪菌；核糖核酸酶；分離純化；理化性質(zhì)

核糖核酸酶（ribonuclease,RNase），是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)的核酸水解酶，其全名為聚核苷-α-寡核苷轉(zhuǎn)移酶。核糖核酸酶的主要生理功能是降解生物體內(nèi)的RNA，控制RNA的種類以及數(shù)量，參與核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解等過程；還與某些植物的自交不親和性、器官發(fā)生、控制腫瘤血管生成[1]、殺滅腫瘤細(xì)胞以及抑制病毒（包括HIV-1）的復(fù)制等有關(guān)[2]。

迄今為止，已經(jīng)從多種大型真菌中分離純化得到的核糖核酸酶有20多種，比如香菇（Lentinus edodes）[3]、刺芹側(cè)耳 （Pleurotus eryngii）[4]、鳳尾菇（Pleurotus sajor-caju）[5]等。這些大型真菌來源的核糖核酸酶的分子量、理化性質(zhì)以及氨基酸序列都存在較大差異，生物學(xué)功能也各不相同。

污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）干酪菌屬（Tyromyces）。污白干酪菌分布于河北、安徽、浙江、湖南、海南、四川、貴州、云南、福建等地，夏秋季生樹木上，可導(dǎo)致木材腐朽。目前對(duì)該菌的研究較少，尤其是生理活性物質(zhì)的研究更少。本文從污白干酪菌的子實(shí)體中分離純化出一種核糖核酸酶，并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行研究，擬為污白干酪菌核糖核酸酶進(jìn)一步的研究應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

污白干酪菌干子實(shí)體。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 核糖核酸酶活性測(cè)定方法

將5 μL酶液加到135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc緩沖液中，然后加入10 μL底物tRNA（10 mg·mL-1）；空白對(duì)照以5 μL去離子水代替酶樣品，其他同樣品管。將其充分混勻后，37℃水浴反應(yīng)15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸終止反應(yīng)，12 000 r·min-1離心5 min后取上清于260 nm處測(cè)定吸光度。

酶活性定義：以260 nm處每分鐘、每毫升反應(yīng)液產(chǎn)生1個(gè)吸光值所需要的酶量作為一個(gè)酶活力單位。

1．2．2 核糖核酸酶粗樣品的制備

稱量污白干酪菌干子實(shí)體10 g，加入200 mL的去離子水組織勻漿破碎，4℃抽提過夜。勻漿液9 000 r·min-1離心10 min，取上清液，得到粗樣品。

1．2．3 DEAE-cellulose陰離子交換層析

粗提取物通過DEAE-cellulose陰離子交換層析，層析柱預(yù)先用10 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8．4） 緩沖液平衡，上樣后以同一緩沖液將不吸附的組分洗脫，再分別用含150 mmol·L-1NaCl、500 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的緩沖液進(jìn)行分段洗脫，得到活性組分。

1．2．4 CM-cellulose陽(yáng)離子交換層析

將DEAE-cellulose陰離子交換層析所得活性組分充分透析后，通過預(yù)先用10 mmol·L-1pH 4．4 NaAc-HAc-緩沖液平衡好的CM-cellulose陽(yáng)離子交換層析柱，上樣之后以同一緩沖液將不吸附的組分洗脫下來，再分別用含150 mmol·L-1NaCl、300 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的緩沖液進(jìn)行分段洗脫，得到活性組分。

1．2．5 FPLC-Superdex-75HR 10/300凝膠過濾層析

將CM-cellulose陽(yáng)離子交換層析所得活性組分充分透析，冷凍干燥，進(jìn)行FPLC-Superdex-75凝膠過濾層析，層析柱預(yù)先用150 mmol NH4HCO3（pH 8．4）緩沖液平衡，即得到活性組分。

1．2．6 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

純化所得的核糖核酸酶通過SDS-PAGE檢驗(yàn)純度及分子量。取20 μL核糖核酸酶樣品，加入5 μL上樣緩沖液，混合后煮沸5 min，12 000 r·min-1離心1 min，取上清，加樣，電泳檢測(cè)。電泳條件：濃縮膠（5%）和分離膠（15%）采用恒壓180 V。電泳完畢后，加入考馬斯亮藍(lán)G-250染色1 h～2 h，脫色液脫色至本底無色，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量并且結(jié)合FPLC結(jié)果計(jì)算分離得到的核糖核酸酶分子量。

1．2．7 RNase氨基酸序列的質(zhì)譜分析

RNase氨基酸序列的質(zhì)譜分析由廣州輝駿生物科技公司完成，所用儀器為納升級(jí)高效液相色譜儀－線性離子肼－靜電場(chǎng)軌道肼質(zhì)譜聯(lián)用儀（nano-flow HPLC-LTQ-Orbitrap mass spectrometer）。

1．2．8 RNase的理化性質(zhì)

最適反應(yīng)pH：配制0．1 mol·L-1不同pH的緩沖液，將純化所得的RNase加入到上述緩沖液中，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，活力最高值為100%，以相對(duì)活力為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的pH值為橫坐標(biāo)作圖。

最適反應(yīng)溫度：將純化所得的RNase在最適pH條件下，分別在4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的溫度下反應(yīng)15 min，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，活力最高值為100%，以相對(duì)活力為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的溫度值為橫坐標(biāo)作圖。

熱穩(wěn)定性：將純化所得的RNase在不同溫度條件下作用1 h后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，未孵育的初始活力值為100%，以相對(duì)活力為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的溫度值為橫坐標(biāo)作圖。

RNase對(duì)寡聚核糖核苷酸的水解作用：以10 mg·mL-1的poly（A）和poly（C）為反應(yīng)底物，將5 μL的酶樣品加入到 135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc緩沖液中，然后加入10 μL底物；空白對(duì)照以5 μL去離子水代替酶樣品，其余都相同。充分混勻后，置于37℃水浴反應(yīng)15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸終止反應(yīng)，12 000 r·min-1離心5 min，poly（A）上清在260 nm處測(cè)定吸光值，poly（C）上清在280 nm處測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 污白干酪菌RNase的分離純化結(jié)果

污白干酪菌RNase洗脫曲線見圖1。

圖1 RNase在DEAE-cellulose和CM-cellulose的洗脫曲線Fig.1 Elution profiles of RNase on DEAE-cellulose column and CM-celllulose column

污白干酪菌子實(shí)體經(jīng)過組織勻漿、抽提后得到的粗樣品通過DEAE-cellulose陰離子交換層析分段洗脫，其洗脫曲線如圖1a所示，得到了4個(gè)組分的洗脫峰D1、D2、D3和D4。經(jīng)過測(cè)定各洗脫峰的RNase酶活性，發(fā)現(xiàn)酶活性主要集中在D3組分。收集D3組分，充分透析，通過CM-cellulose陽(yáng)離子交換層析，得到了4個(gè)峰，洗脫曲線如圖1b所示。通過檢測(cè)RNase活性，發(fā)現(xiàn)RNase活性集中在C2組分。污白干酪菌RNase在Superdex 75的洗脫曲線及SDS-PAGE電泳圖見圖2。

圖2 RNase在Superdex-75洗脫曲線及SDS-PAGE電泳圖Fig.2 FPLC-gel filtration of RNase on Superdex-75 HR 10/300column and SDS-PAGE of fraction SU1

收集C2組分，透析凍干后，進(jìn)行FPLC-Su perdex-75 HR10/300凝膠過濾層析，其洗脫曲線見圖2a，得到2個(gè)洗脫峰SU1和SU2，活性主要集中在SU1。SU1峰呈現(xiàn)的是一個(gè)單一且對(duì)稱的峰，所以初步判斷得到的核糖核酸酶是單一組分。收集SU1活性峰的組分，凍干后電泳檢查純度。污白干酪菌RNase的分子量是25 kDa。

2.2SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果

SU1組分電泳結(jié)果為一條帶（圖2b），結(jié)合在Superdex-75 HR10/300凝膠過濾的結(jié)果，該酶的分子量為25 kDa。

2.3 污白干酪菌RNase的質(zhì)譜結(jié)果分析

通過質(zhì)譜分析，得到的短肽序列用Mascot匹配NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，污白干酪菌RNase蛋白條帶匹配上8個(gè)肽段，分別為：LAAELALR、EVTEISEMDIK、LEINNDKK、SFSQMALLLATWKPMR、QEEVSIPK、NFRNNIDNQLNQGMR、MTYEIGDRLK、NNKDFVCVLMSEIFPSR。

2.4 污白干酪菌RNase的理化性質(zhì)

污白干酪菌RNase的最適pH、溫度，以及在不同pH緩沖液和不同溫度中測(cè)定的酶活性見圖3。

從圖3可以看出，該酶的最適pH及溫度分別為pH 4.4和60℃（圖3a）。pH大于6.0，酶的活性非常低，僅為最高活性的20%及以下，然而在pH 3.0到pH 5.0范圍內(nèi)活性比較高，由此可見該酶是一種酸性核糖核酸酶（acid RNase，ACR）。從溫度對(duì)污白干酪菌RNase活性的影響來看（圖3b），與其他大部分已純化出的核糖核酸酶差不多，在溫度50℃～60℃范圍內(nèi)活性非常高，最適溫度為60℃。溫度高于70℃酶迅速失活。污白干酪菌RNase在不同溫度條件下處理1 h后，酶活性如圖3c所示。溫度低于60℃，酶的活性比較穩(wěn)定，在60℃處理1 h后仍保持有80%的酶活性時(shí)，但溫度高于60℃時(shí)，酶迅速失活。

圖3 污白干酪菌RNase的理化性質(zhì)Fig.3 Characteristics of Tyromyces amygdalinus RNase

RNase對(duì)寡聚核糖核苷酸的水解活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)t-RNA的水解活性，該RNase對(duì)poly（A）、poly（C）均有一定的水解能力，其活性分別為（4.46± 0.4） U·mg-1和（5.33±0.3） U·mg-1，然而對(duì)t-RNA的活性為（40.0±1.9）U·mg-1。

3 結(jié)論

通過各種層析從污白干酪菌中分離純化得到一種核糖核酸酶，其分子量為25 kDa。該酶最適作用溫度和pH分別為60℃和pH 4.4。該酶對(duì)poly（A）和poly（C）均有一定的水解作用。

[1]聶明建,王國(guó)槐.植物核糖核酸酶與轉(zhuǎn)基因工程雄性不育系研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（3）：122-127.

[2]Dewi DL,Ishii H,Haraguchi N,et al.Dicer 1,ribonuclease type III modulates a reprogramming effect in colorectal cancer cells[J].Int J Mol Med,2012,29(6):1060-1064.

[3]Kobayashi H,Itagaki T,Inokuchi N,et al.A new type of RNase T2 ribonuclease in two Basidiomycetes fungi,Lentinus edodes and Irpex lacteus[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003, 67(10):2307-2310.

[4]Ng TB,Wang HX.A novel ribonuclease from fruiting bodies of the common edible mushroom Pleurotus eryngii[J].Peptides,2004,25(8):1365-1368.

[5]Ngai PH,Ng TB.A ribonuclease with antimicrobial,antimitogenic and antiproliferative activities from the edible mushroom Pleurotus sajor-caju[J].Peptides,2004,25(1):11-17.

全球食用菌市場(chǎng)將迎來新發(fā)展階段

據(jù)美國(guó)最新報(bào)道稱，由于全球消費(fèi)者對(duì)有機(jī)產(chǎn)品的需求不斷增加，2018年全球食用菌市場(chǎng)將迎來新的發(fā)展階段。全世界的農(nóng)民已經(jīng)開始著手發(fā)展蘑菇種植，并把它作為更有利可圖的產(chǎn)業(yè)之一。

當(dāng)下，一些因素?cái)U(kuò)大了蘑菇市場(chǎng)高收益系統(tǒng)的發(fā)展，增加了需求飽和，提高了客戶對(duì)產(chǎn)品的增值接受度和改變了超市豐富的產(chǎn)品種類。然而，也有一些制約全球蘑菇市場(chǎng)增長(zhǎng)的因素，比如蘑菇食品的短期保質(zhì)期，添加使用不安全的成分或是防腐劑等。

蘑菇是有營(yíng)養(yǎng)的，應(yīng)對(duì)全世界人民進(jìn)行普及。同時(shí)，增加蘑菇更深層次的研究、開發(fā)更多趣味活動(dòng)，打造更全面的蘑菇創(chuàng)新理念，將進(jìn)一步加速全球蘑菇的市場(chǎng)發(fā)展。

中國(guó)食用菌商務(wù)網(wǎng) 2015.10.30

Purification and Characterization of Ribonuclease from Tyromyces amygdalinus

GENG Xue-ran1,Ryu Mansok2,WANG He-xiang1
（1．State Key Laboratory for Agrobiotechnology and Department of Microbiology,College of Biologial Sciences,China Agricultural University,Beijing 100193,China; 2．Pyongyang KimHyongJik University of Education,Pyongyang 999093,D．P．R．Korea）

A novel ribonuclease (RNase)was purified from dry fruit bodies of Tyromyces amygdalinus using a purification procedure which involved ion exchange chromatography on DEAE-cellulose,CM-cellulose and gel filteration chromatography by FPLC on superdex 75HR 10/300 column．Combine with the result from FPLC and SDS-PAGE,it was estimated that this ribonuclease was a monomeric protein with a molecular weight of 25 kD．The optimum temperature of this RNase is 60℃,and optimum pH of it is 4．4．The activity of this enzyme toward poly A and poly C was lower than that of t-RNA．

Tyromyces amygdalinus;ribonuclease;purification;characterization

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0063-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．016

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金（CARS-24）。

耿雪冉（1988-），女，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)樗幱门c食用真菌。E-mail:gengxueran2007@163．com

**通信作者：王賀祥（1957-），男，博士，教授，主要從事藥用與食用真菌研究。E-mail:hxwang@cau．edu．cn

2015-09-09