方逸群，倪 斌，鄭校先，霍克克*

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)院，上海 200433；2.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海 200051）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）具有遺傳毒性和致癌性，是發(fā)酵食品中普遍存在的代謝產(chǎn)物，是在酒類的生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的，廣泛存在于發(fā)酵酒如葡萄酒、黃酒等產(chǎn)品中[1]。2007年國際癌癥研究機構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）將EC列入Group 2A組，是人類可能的致癌物。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）對所有食品EC污染物開展的系統(tǒng)風險評估研究表明，EC的食品安全風險主要源于高EC含量酒精飲料，建議世界各國采取預(yù)防措施降低飲料酒中氨基甲酸乙酯含量。國際權(quán)威組織機構(gòu)已經(jīng)明確建議降低酒精飲料中氨基甲酸乙酯含量并將其作為食品法典修訂的參考依據(jù)。因此，目前EC及其前體代謝物質(zhì)的生成機制已成為食品行業(yè)的研究熱點。

作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵酒類，黃酒中EC含量普遍高于國際通暢性酒種。尿素是生成EC的重要前體物質(zhì)，經(jīng)酵母代謝可生成氨基甲酸乙酯。尿素普遍存在于發(fā)酵食品的原料及生產(chǎn)過程中。黃酒中大部分的EC由尿素與乙醇反應(yīng)生成。黃酒中富含各種氨基酸，研究表明L-精氨酸等是尿素的主要前體。黃酒釀造過程中，酒體中的精氨酸在精氨酸酶作用下代謝形成尿素，尿素與乙醇反應(yīng)最終形成EC[2-6]。因此，控制黃酒酵母發(fā)酵過程中尿素的生成是黃酒中EC預(yù)防控制措施最為關(guān)鍵的手段之一。

除控制原料中不慎帶入的少量尿素外，降低黃酒中尿素含量的方法主要有：添加脲酶降解尿素，從而降低EC含量[7-8]；自然突變、誘變、雜交等方法的菌種選育[9]；基因敲除或基因過表達的工程菌構(gòu)建[10-15]。本研究以黃酒酵母JF501為出發(fā)菌種，通過比較紫外誘變和基因過表達兩種不同的改良方法，獲得低產(chǎn)尿素的酵母菌種，進而降低了產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌種

14°Bx米曲汁發(fā)酵液：上海石庫門釀酒有限公司；TaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒、抽質(zhì)粒試劑盒、內(nèi)切酶、DNA Marker：大連Takara公司；

黃酒酵母JF501：上海石庫門釀酒有限公司；大腸埃希氏菌（Escherichia coli）Top10、pYX212質(zhì)粒：上海石庫門釀酒有限公司實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast peptone dextrose，YPD）：2%蛋白胨、1%酵母粉、2%葡萄糖、2%瓊脂。

初篩培養(yǎng)基采用刀豆氨酸-精氨酸-鳥氨酸培養(yǎng)基（canavanine arginine ornithine，CAO）：0.17%酵母碳源基礎(chǔ)（yeast carbonbase，YCB）培養(yǎng)基（不含氮）、刀豆氨酸10 mg/L、精氨酸1 mmol/L、鳥氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂。

復(fù)篩培養(yǎng)基采用（1）精氨酸培養(yǎng)基（arginine medium，AM）：0.17%YCB培養(yǎng)基（不含氮）、精氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂；（2）鳥氨酸培養(yǎng)基（ornithine medium，OM）：0.17%YCB培養(yǎng)基（酵母碳源基礎(chǔ)，不含氮）、鳥氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉（固體培養(yǎng)基加2%瓊脂）。

1.1.3 主要化學(xué)試劑及溶液的配制

醋酸鋰、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸、硫酸、二乙酰一肟、氨基硫脲（均為分析純）、EC標準品（優(yōu)級純）：上海虹口東風化學(xué)試劑有限公司。

酸鐵溶液的配制：100 mL磷酸和300 mL硫酸，加到含有0.1 g三氯化鐵的600 mL蒸餾水中。

二乙酰一肟溶液的配制：稱取二乙酰一肟0.900 g，溶于80 ℃左右的蒸餾水中，定容至50 mL棕色容量瓶中。

氨基硫脲溶液的配制：稱取氨基硫脲0.030 g，溶于80 ℃左右的蒸餾水中，定容至50 mL棕色容量瓶中。

尿素檢測顯色劑的配制：臨用前取二乙酰一肟溶液∶氨基硫脲（1∶1，V/V）混勻，2 h內(nèi)有效。

尿素標準儲備液的配制：稱取尿素0.100 g，用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，尿素標準儲備液質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL。

尿素標準使用液：分別移取質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL尿素標準儲備液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL，分別定容至100 mL容量瓶中，尿素標準使用質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BS210S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；PTC-200型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國MJ Research公司；FR-250型電泳儀：上海復(fù)日科技有限公司；UV-2102紫外可見光分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；2695高效液液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；5975C氣相色譜儀、6890N質(zhì)譜儀、萃取頭為65 μm PDMS/DVB固相微萃?。好绹步輦惪萍加邢薰?。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種改良方法

（1）紫外誘變

對出發(fā)菌種黃酒酵母JF501分別進行不同時長的紫外照射，照射距離30 cm，誘變時間0.5 min、1.0 min、2.0 min、3.0 min、4.0 min、5.0 min。誘變后進行恢復(fù)培養(yǎng)，并使用CAO培養(yǎng)基為初篩培養(yǎng)基，精氨酸培養(yǎng)基（AM）及鳥氨酸培養(yǎng)基（OM）為復(fù)篩培養(yǎng)基，在AM上不生長而在OM上生長的酵母菌株即可判斷為目的菌株：精氨酸酶缺陷型酵母菌株。目標菌株在發(fā)酵過程中無法分解精氨酸產(chǎn)生尿素，從而降低了產(chǎn)品中尿素的含量，進一步能降低EC的含量[16]。紫外誘變的篩選原理如圖1所示。誘變率、致死率計算公式如下：

圖1 紫外誘變篩選示意圖Fig.1 Diagram of UV-induced mutagenesis

（2）黃酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

構(gòu)建含有脲基酰胺酶基因編碼框的重組表達載體pYX212-DUR1,2及含抗生素標記的共轉(zhuǎn)載體pYX212-Sh ble的重組酵母菌株，通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方式（醋酸鋰法）將其轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株JF501，并使用含有抗生素博萊霉素（zeocin）的選擇性完全培養(yǎng)基（YPD）進行篩選，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，獲得目標菌株[17-18]。表1列出主要引物序列，其中引物1、2用于構(gòu)建表達載體，引物3、4用于構(gòu)建共轉(zhuǎn)載體，引物5、2用于鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

表1 構(gòu)建載體的主要引物序列Table 1 Primers sequences for carrier establishment

1.3.2 發(fā)酵試驗方法

（1）發(fā)酵性能試驗

將菌株于米曲汁瓊脂斜面上劃線30 ℃培養(yǎng)24 h進行活化；取活化后菌種一環(huán)接入14°Bx的米曲汁發(fā)酵液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，并將該酵母種子液濃度調(diào)整至107個/mL；將種子液接種至14°Bx的三角瓶米曲汁發(fā)酵液中，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h稱質(zhì)量一次，當質(zhì)量損失＜0.2 g/d時，認為發(fā)酵結(jié)束。

（2）發(fā)酵釀酒試驗

分別采用獲得的改造菌株與出發(fā)菌株進行黃酒的發(fā)酵試驗。將目的菌株活化制成酒母，按表2比例投料，進行模擬發(fā)酵釀酒試驗。投料溫度控制在28 ℃，經(jīng)過前發(fā)酵、后發(fā)酵、壓榨、煎酒后獲得黃酒產(chǎn)品。

表2 釀酒試驗的投料比例Table 2 Formula of wine fermentation tests

1.3.3 分析檢測

（1）黃酒常規(guī)理化指標檢測

參照國家標準GB/T 13662—2008《黃酒》中的方法，測定黃酒的酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、β-苯乙醇等理化指標。

（2）精氨酸含量的檢測

參照行業(yè)標準QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定高效液相色譜法》中的方法，測定黃酒中精氨酸含量。

（3）尿素含量的檢測

采用分光光度計法測定尿素含量。取不同質(zhì)量濃度的尿素標準使用液200 μL于試管中，再分別加入3 mL酸鐵溶液和1 mL顯色劑，蓋上塞子搖勻。置于沸水浴中反應(yīng)15 min，取出后冰水迅速冷卻3 min，并用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。在波長525 nm處測定其吸光度值，繪制尿素標準曲線[19]。

樣品按相同處理后進行測定，以標準曲線回歸方程計算樣品中尿素含量。

（4）EC含量的檢測[20]

吸取100 mL不同質(zhì)量濃度的EC標準溶液（20 μg/L，50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L）于三角瓶中，加入1.5 mL、300 g/L的NaOH溶液，混勻；吸取5 mL上述溶液，加入2 g NaCl，混勻；采用固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）于70 ℃頂空吸附15 min；240 ℃下解析1 min，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進行EC含量分析檢測。

氣相色譜（GC）條件：毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度35 ℃（0 min），以5 ℃/min升至80 ℃，再以15 ℃/min升至110 ℃；進樣方式：分流進樣（分流比60∶1）；載氣：高純氦氣（純度99.999%）、載氣流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，接口溫度230 ℃，電子倍增器電壓1 568 V，檢測離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62，同時m/z 50～200全掃描進行驗證。

使用SPME固相微萃取前處理方法，結(jié)合GC/MS外標法檢測黃酒中EC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素標準曲線

以尿素質(zhì)量濃度為（x）橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制尿素標準曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 尿素標準曲線Fig.2 Standard curve of urea

由圖2可知，標準曲線回歸方程為y=0.006 2x-0.007 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明尿素質(zhì)量濃度和吸光度值在10～100 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，因此，該標準曲線滿足黃酒中尿素含量的測定要求。

2.2 目標菌株的獲得

2.2.1 紫外誘變

以黃酒酵母JF501為出發(fā)菌株，進行不同時間的紫外誘變，經(jīng)過培養(yǎng)基篩選，選出精氨酸酶缺陷型酵母代表菌株，不同誘變時間的紫外誘變結(jié)果見表3。

表3 不同誘變時間的紫外誘變結(jié)果Table 3 Ultraviolet mutagenic results with different mutagenesis time

由表3可知，根據(jù)目標菌株釀酒試驗獲得的產(chǎn)品中尿素含量，經(jīng)過紫外誘變，經(jīng)過初篩和復(fù)篩后獲得6株菌，發(fā)酵產(chǎn)品中尿素的含量均低于對照組，說明紫外誘變獲得了低產(chǎn)尿素的菌株。比較表3的結(jié)果，誘變時間在0.5～5.0 min時，隨著誘變時間的增加，致死率升高、突變率提高（其中誘變時間4.0 min時突變率最高）、產(chǎn)品中尿素含量減少（其中誘變時間5.0 min時尿素含量最低）；誘變時間＞5.0 min（數(shù)據(jù)未列出）致死率進一步升高，但突變率和尿素含量變化不明顯。因此紫外誘變時間在4.0 min及5.0 min為宜，選擇JF501-A62、JF501-A83進行發(fā)酵性能試驗。

2.2.2 發(fā)酵性能試驗

黃酒酵母的發(fā)酵度是重要的發(fā)酵特性之一，它反映了酵母對糖的利用能力。黃酒酵母菌發(fā)酵米曲汁時釋放CO2，使發(fā)酵液質(zhì)量損失。因此根據(jù)發(fā)酵液的質(zhì)量損失速率可以大致了解其發(fā)酵速率。將誘變菌株JF501-A62、JF501-A83進行發(fā)酵性能試驗，并測定發(fā)酵144 h的理化指標，結(jié)果見圖3和表4。

由圖3可知，誘變菌株JF501-A62的發(fā)酵速率達到與出發(fā)菌株相近的水平，而JF501-A83發(fā)酵速率初期緩慢，后期逐步慢提升至與出發(fā)菌株相近的水平，說明JF501-A62發(fā)酵速率與出發(fā)菌株更相近、更能符合發(fā)酵需求，而JF501-A83初期發(fā)酵緩慢，容易使酒體寡淡無味，因此在發(fā)酵性能方面JF501-A62更優(yōu)。

圖3 紫外誘變菌種發(fā)酵速率曲線Fig.3 Fermentation rate curve of strains generated by UV-induced mutagenesis

表4 紫外誘變菌株發(fā)酵性能試驗結(jié)果Table 4 Results of fermentation performance test of strains generated by UV-induced mutagenesis

由表4可知，與JF501相比，誘變菌株的總質(zhì)量損失、總糖含量及總酸含量基本不變，JF501-A62的酒精度與出發(fā)菌種相近，但JF501-A83的產(chǎn)酒精能力大大下降，酒精度僅為5.37%vol，無法滿足釀酒需求。因此綜合發(fā)酵速率及各項理化指標的對比，選擇誘變菌株JF501-A62為紫外誘變的最佳目標菌株。

2.2.3 黃酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

構(gòu)建重組表達載體pYX212-DUR1,2及含抗生素標記的共轉(zhuǎn)載體pYX212-Sh ble的重組酵母菌株，通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方式（醋酸鋰法）將其轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株JF501，并使用含有抗生素博萊霉素（zeocin）的選擇性完全培養(yǎng)基（YPD）進行篩選，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of yeast transformants

由圖4可知，1-4為篩選到含有DUR1,2基因的菌株，PCR得到引物5、2擴增的條帶大小為5.5 kb，但未含有啟動子TPI1；5為PCR得到引物5、2擴增出來的條帶，說明啟動子TPI1及DUR1,2已同時整合到酵母中。因此5為1株DUR1,2過表達酵母菌種，命名為JF501-B5。

對目的菌株進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵時間為144 h，檢測發(fā)酵液的各種理化指標，結(jié)果如圖5及表5所示。由圖5可知，JF501-B5在發(fā)酵初期發(fā)酵速率比出發(fā)菌株快，后期與出發(fā)菌株持平，說明菌株JF501-B5發(fā)酵速率與出發(fā)菌株相近、可以滿足發(fā)酵需求。

圖5 基因過表達菌種發(fā)酵速率曲線Fig.5 Fermentation rate curve of strains generated by gene over-expression

由表5可知，目標菌株發(fā)酵液的總質(zhì)量損失、總糖、總酸和酒精度與出發(fā)菌株發(fā)酵液的無明顯差異，且產(chǎn)品中尿素含量大大降低，由32.15 mg/L降至3.84 mg/L，因此可判定JF501-B5能夠正常發(fā)酵，為基因過表達的目標菌株。

2.3 改良菌株進行釀酒試驗獲得的產(chǎn)品指標比較

將JF501-A62、JF501-B5和JF501作為酒母菌種，對發(fā)酵后的黃酒進行常規(guī)理化指標測定，結(jié)果見表6；精氨酸、尿素及EC含量的測定，結(jié)果見表7。

由表6可知，2株菌株均正常發(fā)酵，獲得黃酒產(chǎn)品。與出發(fā)菌株相比，改造菌株釀造的黃酒在出酒率、酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮和β-苯乙醇沒有明顯的差異，且各發(fā)酵產(chǎn)物指標均符合國家標準GB/T 13662—2008《黃酒》的要求。

表7 出發(fā)菌株與目標菌株釀酒產(chǎn)品精氨酸、尿素、EC含量的比較Table 7 Comparison of arginine,urea and EC in Chinese rice wine fermented by original strain and target strain

由表7可知，與出發(fā)菌株相比，JF501-A62由于是精氨酸酶缺陷型，精氨酸無法正常代謝生成尿素，因此產(chǎn)品中累積較多的精氨酸含量；JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)品中精氨酸含量則與出發(fā)菌株基本持平，而兩者產(chǎn)品中尿素和EC含量均有顯著降低，JF501-A62發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了67%，EC含量降低了59%；JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了88%，EC含量降低了63%。經(jīng)過6個月貯存期，3個產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量都有所增加，但JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量始終最低，且增加量最少。說明JF501-B5在降低產(chǎn)品中尿素、EC含量方面更優(yōu)，是最佳目的菌株。

3 結(jié)論

本研究通過紫外誘變和基因重組試驗，篩選獲得2株改良黃酒酵母菌種，即紫外誘變菌株JF501-A62和基因過表達菌株JF501-B5。經(jīng)過改良菌種發(fā)酵獲得黃酒產(chǎn)品及對其理化指標進行檢測可知，與出發(fā)菌株相比，改造菌株釀造的發(fā)酵性能和黃酒的出酒率、酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮和β-苯乙醇沒有明顯的差異。而誘變菌株JF501-A62發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了67%，EC含量降低了59%；基因過表達菌株JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了88%，EC含量降低了63%。兩者均有很好的發(fā)酵性能，并取得了較好地降低產(chǎn)品中尿素含量、進而降低氨基甲酸乙酯含量的效果。與紫外誘變相比，基因過表達的改良方法獲得了尿素含量更低的菌株，并在一段時間的貯存期之后產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量更低。這一菌株改良方法能有效降低黃酒中EC的含量，為解決黃酒行業(yè)中存在的由氨基甲酸乙酯造成的潛在食品安全問題打下扎實基礎(chǔ)。

[1]WEBER J V,SHARYPOV V I.Ethyl carbamate in foods and beverages:a review[J].Environ Chem Lett,2009,7(3):233-247.

[2]BELTRAN G,NOVO M,ROZèS N,et al.Nitrogen catabolite repression inSaccharomyces cerevisiaeduring wine fermentations[J].Feder Eur Microbiol Soc Yeast Res,2004,4(6):625-632.

[3]ZHAO X R,ZOU H J,FU J W,et al.Nitrogen regulation involved in the accumulationof ureainSaccharomycescerevisiae[J].Yeast,2013,30(11):437-447.

[4]王 賓，楊 勇.傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵過程中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸濃度變化規(guī)律的研究[J].釀酒，2013，40（1）：57-60.

[5]孫雙鴿，白衛(wèi)東，錢 敏，等.從黃酒的釀造工藝上探討氨基甲酸乙酯[J].中國釀造，2013，32（12）：9-13.

[6]羅蘇僅，白衛(wèi)東，趙文紅，等.發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯形成的代謝途徑及控制[J].中國釀造，2013，32（9）：9-12.

[7]周建弟，丁關(guān)海，鄭志強.酸性脲酶分解黃酒中尿素特性的研究[J].中國釀造，2006，25（11）：45-47.

[8]王松華，田亞平.產(chǎn)酸性脲酶菌株的篩選、鑒定及其脲酶的應(yīng)用初探[J].生物技術(shù)通報，2008，24（6）：175-178.

[9]馬力輝，孫 輝，齊明君，等.酶電極法測定發(fā)酵酒中尿素含量[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（9）：223-226，281.

[10]GENBAUFFE F S,COOPER T G.Induction and repression of the urea amidolyase gene inSaccharomyces cerevisiae[J].Mol Cell Biol,1986,6(11):3954-3964.

[11]方若思，董亞晨，徐騰洋，等.精氨酸代謝酶對傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵氨基甲酸乙酯產(chǎn)生的調(diào)控作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報，2013，39（2）：203-208.

[12]KATSUHIKO K,ODA K,GOMI K,et al.Genetic engineering of a sake yeast producing no urea by successive disruption of arginase gene[J].Appl Environ Microbiol,1991,57(1):301-306.

[13]COULON J,HUSNIK J I,INGLIS D L.Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiaeto minimize the production of ethyl carbamate in wine[J].Am J Enol Viticult,2006,57(2):113-124.

[14]DAHABIEH M S,HUSNIK J I,VUUREN H J J.Functional enhancement of Sake yeast strains to minimize the production of ethyl carbamate in Sake wine[J].J Appl Microbiol,2010,109:963-973.

[15]趙然然，陸 健，謝廣發(fā).基于PCR 方法敲除黃酒酵母精氨酸酶基因的工程菌構(gòu)建[J].食品工業(yè)科技，2012，33（17）：159-162.

[16]王曉娟.低產(chǎn)尿素黃酒酵母的選育及黃酒發(fā)酵工藝研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009.

[17]江南大學(xué).低尿素工業(yè)黃酒酵母代謝工程菌及其構(gòu)建方法：中國，201310728796.8[P].2014.04.09.

[18]朱旭亞，陸 健，謝廣發(fā).脲基酰胺酶基因在黃酒酵母中的整合型表達[J].食品工業(yè)科技，2012，33（17）：173-183.

[19]王立媛，馮 靚，吳平谷，等.分光光度法測定黃酒中尿素含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（11）：3059-3061.

[20]鐘其頂，姚 亮，熊正河.采用GC/MS 和HPLC-FLD2 種方法測定黃酒中的EC 含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（3）：115-119.