宋勇強(qiáng)，胡先望，張鳴明，嚴(yán)曉娟，沙芮，梁寧

(甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730010)

普魯蘭酶(pullulanase，EC.3.2.1.41)是應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)脫支酶［1］，因?yàn)槟芩馄蒸斕m糖分子中的α-(1→6)糖苷鍵而得名［2］，能夠?qū)Ｒ恍缘刈饔糜诤肿雍椭ф湹矸?，有效地切開(kāi)其中分支點(diǎn)處的α-(1→6)糖苷鍵，將各分子支鏈脫落［3］，最終使糊精分子或支鏈淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)橹缓笑?(1→4)糖苷鍵的直鏈低聚糖或支鏈淀粉。由于這類(lèi)脫支酶能夠分解最小單位的支鏈，有效地提高了淀粉利用率，因此在淀粉加工工業(yè)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景，是實(shí)際應(yīng)用非常廣泛、市場(chǎng)需求量相對(duì)較大的一類(lèi)酶［4-5］。

在1943 年，科學(xué)家Myrback 首次發(fā)現(xiàn)植物普魯蘭酶，1961 年，微生物普魯蘭酶被Wallenfels 和Bender 通過(guò)產(chǎn)氣氣桿菌Aerobacter aerogenes(典型菌為肺炎克雷伯氏桿菌)發(fā)酵獲得［5］。之后，各國(guó)微生物及酶工程領(lǐng)域的相關(guān)專(zhuān)家和科研人員開(kāi)始對(duì)微生物普魯蘭酶及其應(yīng)用展開(kāi)了更為深入的研究，并且在不同地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多能夠產(chǎn)生該類(lèi)酶的不同種屬的微生物，并篩選出了其中一些適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，如熱球菌屬的Thermococcus hydrothermalis［6］、鏈霉菌屬的Streptomyces flavochromogenes［7］、厭 氧 分 支 桿 菌 屬 的Anaerobranca gottschalkii［8］、克雷伯氏菌屬的Klebsislla aerogenes［9］、芽孢桿菌屬的Bacillus flavocaldarius［10］、火球菌屬的Pyrococcus woesei［11］、鏈球菌屬的Streptococcus pneumonia［12］等。

目前，國(guó)內(nèi)淀粉工業(yè)中使用的普魯蘭酶大多都是從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴、成本太高，迫切需要國(guó)內(nèi)科研人員篩選出能夠應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良普魯蘭酶酶源菌并對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)的普魯蘭酶進(jìn)行應(yīng)用研究工作，力爭(zhēng)研究和開(kāi)發(fā)出我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的普魯蘭酶酶產(chǎn)品，以擺脫對(duì)國(guó)外進(jìn)口的依賴(lài)。經(jīng)過(guò)這些年的努力和研究，國(guó)內(nèi)已有一些實(shí)驗(yàn)室通過(guò)純培養(yǎng)或者基因重組的方法篩選得到了一些產(chǎn)普魯蘭酶優(yōu)勢(shì)酶源菌，包括產(chǎn)氣氣桿菌［13］、嗜熱厭氧菌［14］、厭氧古細(xì)菌［15］、嗜熱芽孢桿菌［16］、棲熱水生菌、多粘芽孢桿菌等，但是還未見(jiàn)報(bào)道通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法篩選獲得解淀粉芽孢桿菌屬來(lái)源的普魯蘭酶，本研究從甘肅定西淀粉加工廠附近的土壤中分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶優(yōu)勢(shì)菌株AI-1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件做了進(jìn)一步的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

以甘肅省定西市某淀粉加工廠附近的土壤作為試驗(yàn)分離材料，分離出一株產(chǎn)酶活性較高的普魯蘭酶酶源菌AI-1。

酵母膏、牛肉膏、蛋白胨均為生物試劑;曲里苯藍(lán)、普魯蘭糖均為優(yōu)級(jí)純;氫氧化鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、無(wú)水葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀均為分析純。

DK-S12 電熱恒溫水浴鍋;FA1204B 電子分析天平;LDZM-75 型立式智能壓力蒸汽滅菌器;SW-CJ-1FD 型單人單面凈化工作臺(tái);HG303-4A 電熱恒溫培養(yǎng)箱;TU-1800pc 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);GL-21M湘儀離心機(jī);PHS-3C 型酸度計(jì);eppendorf 移液槍;THZ-82N 臺(tái)式恒溫振蕩器培養(yǎng)箱。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 平板分離培養(yǎng)基(LBSP 培養(yǎng)基) 蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%，普魯蘭糖0.01%，曲里苯藍(lán)0.01%，用5 mol/L NaOH 調(diào)pH至7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.2 分離純化培養(yǎng)基 可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH 7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.3 種子培養(yǎng)基 酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.0 ～7.2，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，酵 母 膏1. 5%，MgSO4·7H2O 0. 05%，pH 7. 0，0. 1 MPa 滅 菌30 min。

1.2.5 斜面保藏培養(yǎng)基 蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH 7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.3 菌株篩選［17］

裝有9 mL 無(wú)菌水的試管中，加入含土樣的菌液1.0 mL，梯度稀釋獲得濃度分別為10－4，10－5，10－6，10－7的菌懸液。從中任意選取3 個(gè)稀釋度，用Eppendorf 移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL 于干凈無(wú)菌的培養(yǎng)皿中(每一個(gè)稀釋梯度做2 個(gè)平行)，將溫度冷卻到45 ℃左右的平板分離培養(yǎng)基溶液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入12 ～15 mL，搖勻，待培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基凝固后，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中30 ℃下倒置培養(yǎng)48 h。采用曲里苯藍(lán)法篩選產(chǎn)普魯蘭酶酶源菌。當(dāng)產(chǎn)普魯蘭酶酶源菌代謝產(chǎn)生普魯蘭酶時(shí)，會(huì)水解培養(yǎng)基成分中的普魯蘭多糖，使得菌株周?chē)乃{(lán)色褪去，出現(xiàn)透明圈。從分離培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)一致，H/C 值(透明圈直徑與菌落直徑的比值)較大的單菌落，劃線純化后于接種于斜面保藏培養(yǎng)基上保藏。進(jìn)行酶活力測(cè)定和形態(tài)及生理化鑒定。

普魯蘭酶活性定義:在50 ℃，pH 值6.0 條件下，每分鐘催化分解普魯蘭糖產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1 個(gè)酶活單位，以U/mL 表示。

1.4 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱(chēng)量葡萄糖(105 ℃溫度下干燥恒重)0.100 0 g，在 100 mL 容 量 瓶 中 配 制 成 濃 度1.0 mg/mL的母液。用移液槍準(zhǔn)確量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 母液于9 支試管中，用pH 6.0 濃度0.02 mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液補(bǔ)充至2 mL。加入1.0 mL DNS(3，5-二硝基水楊酸)溶液，在沸水浴中放置5 min。冷卻，定容到15 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)540 nm 下的OD540nm值(每管中的溶液做3 次平行，取平均值)。以葡萄糖的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、OD540nm值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1)，得到回歸方程Y =0.926 2X+ 0.032，R2=0.997 2。

圖1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.5 普魯蘭酶酶活力測(cè)定

采用DNS 法(3，5-二硝基水楊酸法)測(cè)定普魯蘭酶活性。裝有1.0 mL 0.5%的普魯蘭糖溶液的試管中，加入1.0 mL 濃度0.02 mol/L pH 6.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1.0 mL 普魯蘭酶酶液(即處理后的菌種發(fā)酵液)，在恒溫水浴鍋中50 ℃下反應(yīng)20 min。加入1.0 mL DNS 溶液，沸水浴5 min。冷卻后，加蒸餾水定容至15 mL，振蕩搖勻后測(cè)OD540nm值。

酶活力(U/mL)=［(Y－0.032)/0.926 2］×Df×1 000/(180 ×t)

式中，Y 為吸光度值OD540nm;Df 為待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù);t 為反應(yīng)時(shí)間(min);180 為葡萄糖的分子量;1 000 為單位換算倍數(shù)。

1.6 形態(tài)及生理生化鑒定

依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［18］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》［19］對(duì)產(chǎn)普魯蘭酶菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.7 菌株16S RNA 序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建［20］

挑取純化后的普魯蘭酶酶源菌單菌落接種于裝有10 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)24 h。用移液槍準(zhǔn)確的吸取2 mL 菌液，在低溫高速冷凍離心機(jī)中以12 000 r/min 離心2 min，去除上清液，按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)的試驗(yàn)步驟提取菌株的基因組DNA，作為模板。

首先進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增，采用引物(上游:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;下游:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，建 立 PCR 反 應(yīng) 體 系(25 μL):上游引物0.5 μL;下游引物0.5 μL;Template(基因組)1 μL;dNTP 0.5 μL;Taq (5 U/μL)0.2 μL;10 ×反應(yīng)緩沖液2.5 μL;最后加水補(bǔ)充至25 μL。

設(shè)定PCR 程序:在高溫94 ℃下預(yù)變性5 min 后進(jìn)入循環(huán)程序:94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火35 s，72 ℃下延伸1 min，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下保溫8 min。

用Eppendorf 移液槍準(zhǔn)確地吸取50 μL 進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA 目的條帶，純化以后進(jìn)行后續(xù)DNA 的測(cè)序工作，將提取的基因組DNA 委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA 基因擴(kuò)增序列測(cè)序。在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中提交測(cè)序結(jié)果，通過(guò)BLAST 程序提交得到的16S rRNA 序列，最后在NCBI 在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列檢索。將目標(biāo)菌株的16S rDNA和在BLAST 程序中檢索到的與之有較高同源性的模式菌株的16S rDNA 作最大同源性比較分析，并利用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA 4.0 采用鄰位相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)進(jìn)行重復(fù)次數(shù)為1 000 次的Bootstrap 測(cè)試，最終確定目標(biāo)菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株篩選

在所采集的土壤中，共分離出在曲里苯藍(lán)培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的菌株12 株，其中菌株AI-1 的H/C 值最大。

將產(chǎn)普魯蘭酶酶源菌經(jīng)分離純化后，接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液中普魯蘭酶的酶活，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力比較Fig.2 The comparison of several strains in fermentation enzyme

由圖2 可知，所選菌株在搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)時(shí)都能產(chǎn)生胞外普魯蘭酶，其中，菌株AI-1 的酶活達(dá)到了2.45 U/mL，而其他菌株所產(chǎn)的普魯蘭酶酶活均低于2.0 U/mL;故選取菌株AI-1 作為目標(biāo)菌株，進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化等一系列后續(xù)研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 AI-1 菌株個(gè)體形態(tài) 菌株AI-1 革蘭氏染色呈陽(yáng)性，其顯微鏡下的鏡檢形態(tài)見(jiàn)圖3。

2.2.2 菌落群體形態(tài) 在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株AI-1 的菌落呈白色(圖4)，單個(gè)菌落近似圓形，邊緣較整齊，半透明，菌落表面光滑濕潤(rùn)。

圖3 菌株AI-1 的鏡檢形態(tài)Fig.3 The micrograph of bacterial strain AI-1

圖4 AI-1 的平板培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.4 Colonial morphology of bacterial strain AI-1

由圖3 可知，菌體形態(tài)為長(zhǎng)桿狀，大小為0.8 μm×3.2 μm，形成芽孢，芽孢呈現(xiàn)卵圓形，單個(gè)或成鏈排列。

2.2.3 菌株生理生化鑒定 菌株AI-1 的生理生化特征見(jiàn)表1。

表1 菌株AI-1 的生理生化特征Table 1 The physiological and biochemical characteristics of bacterial strain AI-1

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)中提供的檢索表和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》分類(lèi)系統(tǒng)中的描述，對(duì)比菌株AI-1 的鏡檢、平板形態(tài)特征及其一系列菌株生理生化鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株AI-1屬于芽孢桿菌屬。

2.2.4 菌株16S rRNA 基因序列鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 由圖5 可知，經(jīng)電泳檢測(cè)，其PCR 產(chǎn)物為一個(gè)大小約為1 400 bp 的特異性片段，菌株AI-1 的16S rRNA 全長(zhǎng)序列大小為1 451 bp。在NCBI 在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其與Bacillus屬中編號(hào)為HE716936.1 的菌株Bacillus amyloliquefaciens 的同源性高達(dá)到99.6%，借助構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育MEGA 4.0 軟件生成直觀清晰的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。

圖5 菌株AI-1 的PCR 產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 The electrophoresis pattern of PCR products of bacterial strain AI-1

圖6 菌株AI-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 The system evolutionary tree of strain AI-1

由圖6 可知，菌株AI-1 與Bacillus amyloliquefaciens(KJ009413.1)處在同一個(gè)分支上，通過(guò)1 000次bootstrap 測(cè)試分析支持該分支;并且在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，菌株AI-1 與模式菌株Bacillus amyloliquefaciens(KJ009413.1)的16S rRNA 基因序列相似度為99.6%。由此推斷，菌株AI-1 為Bacillus 屬中的Bacillus amyloliquefaciens。

綜上所述，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和菌株16S rRNA 序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終將菌株AI-1 鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

圖7 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 The effect of different carbon sources on enzyme production

2.3.1 碳源種類(lèi)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)基中加入不同類(lèi)型的碳源對(duì)菌株產(chǎn)生普魯蘭酶的影響見(jiàn)圖7。由圖7 可知，在培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉的效果最好，可以使胞外酶活達(dá)到4.16 U/mL 的水平;其次是支鏈淀粉，酶活達(dá)3.86 U/mL;而在使用葡萄糖或者蔗糖作為碳源時(shí)，酶活卻很低。此外，使用普魯蘭糖、馬鈴薯淀粉或者玉米淀粉作為碳源時(shí)，也能產(chǎn)生較高酶活的普魯蘭酶。因此，也間接的證明了普魯蘭酶是一種誘導(dǎo)型的酶，只有當(dāng)環(huán)境中存在含有α-(1→6)糖苷鍵的誘導(dǎo)物時(shí)，普魯蘭酶才能得到合成，并具有較高的酶活。

2.3.2 可溶性淀粉濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 可溶性淀粉的添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖8。

圖8 可溶性淀粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of different concentrations of soluble starch on Pullulanase production

由圖8 可知，可溶性淀粉的添加量(即碳源的濃度)對(duì)菌株產(chǎn)酶能力有顯著影響，添加量過(guò)少，不僅滿(mǎn)足不了菌體生長(zhǎng)所需要的能量，而且也不能充分地誘導(dǎo)菌株發(fā)酵產(chǎn)生普魯蘭酶;添加量過(guò)多，同樣不利于普魯蘭酶的積累，雖然理論上可以為菌株產(chǎn)酶提供更多的作用底物和生長(zhǎng)所需能量，但高濃度的碳源底物反而會(huì)由于底物抑制的緣故對(duì)菌株產(chǎn)酶產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)可溶性淀粉的濃度到達(dá)1.5 g/mL 時(shí)，酶活最高，繼續(xù)增加可溶性淀粉的濃度，酶活則開(kāi)始降低。

2.3.3 不同種類(lèi)的氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 幾種常見(jiàn)的有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖9。

圖9 不同種類(lèi)氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 The effect of different nitrogen sources on enzyme production

由圖9 可知，有機(jī)氮源中的酵母膏對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶優(yōu)于其他氮源，蛋白胨其次;與無(wú)機(jī)氮源如硝酸銨、醋酸銨等相比，有機(jī)氮源(如酵母膏、蛋白胨)更有利于菌體發(fā)酵產(chǎn)酶，而在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了無(wú)機(jī)氮源以后，隨著無(wú)機(jī)氮源的被利用，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值也會(huì)發(fā)生變化，從而引起菌體生長(zhǎng)環(huán)境酸堿度的變化，對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)生一定的影響。所以，為了避免菌體生長(zhǎng)環(huán)境pH 發(fā)生變化，宜選取有機(jī)氮源作為菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵所需的氮源。

2.3.4 酵母膏濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 酵母膏的添加量對(duì)普魯蘭酶產(chǎn)生的影響見(jiàn)圖10。

圖10 酵母膏濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of different concentrations of yeast extract on Pullulanase production

由圖10 可知，隨著酵母膏濃度的增大，菌體所產(chǎn)普魯蘭酶的酶活也隨之增大，濃度1.0 g/mL 時(shí)，酶活達(dá)到最大;之后隨著酵母膏濃度的繼續(xù)增大，普魯蘭酶的酶活開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，這可能是由于加入的氮源量過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致微生物菌體的生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，不利于代謝產(chǎn)物普魯蘭酶的積累。

有關(guān)研究表明［21］，產(chǎn)酶微生物添加復(fù)合氮源時(shí)，產(chǎn)酶的效果要優(yōu)于單一氮源，而且有機(jī)氮源優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，并且在考察不同氮源對(duì)普魯蘭酶的影響中發(fā)現(xiàn)，蛋白胨與其他有機(jī)氮源如酵母膏、牛肉膏等組合作為微生物菌體氮素的來(lái)源時(shí)，菌體在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)代謝更旺盛、發(fā)酵產(chǎn)酶能力更佳，而且蛋白胨不僅富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類(lèi)，作為微生物培養(yǎng)基的成分，十分有利于微生物菌株的生長(zhǎng)代謝［22］。因此，本研究也考察了單一有機(jī)氮源與復(fù)合有機(jī)氮源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，即在單一氮源的基礎(chǔ)上添加1%的蛋白胨作為復(fù)合有機(jī)氮源的組合，結(jié)果見(jiàn)圖11。

由圖11 可知，產(chǎn)酶微生物在添加復(fù)合氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)酶效果要優(yōu)于只添加單一碳源的培養(yǎng)基，而其中酵母膏和蛋白胨的組合對(duì)于菌株產(chǎn)酶效果最佳，酶活可達(dá)4.0 U/mL 以上。

圖11 復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.11 The effect of complex nitrogen sources on enzyme production

2.3.5 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)普魯蘭酶產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖12。

圖12 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.12 The effect of temperature on enzyme production

由圖12 可知，當(dāng)溫度從30 ℃升高到36 ℃左右時(shí)，菌體發(fā)酵液中的酶活力隨著溫度的升高而增大，之后，隨著溫度的繼續(xù)升高酶活力呈急劇下降趨勢(shì)，到達(dá)50 ℃時(shí)發(fā)酵液中的普魯蘭酶接近失活。

2.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖13。

圖13 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.13 The effect of initial pH culture medium on enzyme production

由圖13 可知，菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的酶活隨著pH 的增大而增大，pH 為7.0 左右時(shí)，酶活力達(dá)到最大;之后，隨著pH 的繼續(xù)增大，酶活呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)。

2.3.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將接種菌株AI-1 的種子液接入裝有100 mL 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 容量三角瓶中，在30 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6 h 取樣在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值(以O(shè)D600 表示)，以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，結(jié)果見(jiàn)圖14。

圖14 菌株AI-1 生長(zhǎng)曲線Fig.14 The growth curve of strain AI-1

由圖14 可知，解淀粉芽孢桿菌AI-1 在經(jīng)歷了短暫的延遲期之后，在培養(yǎng)18 h 之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(18 ～60 h)，菌體生長(zhǎng)速率加快、代謝旺盛，培養(yǎng)基中的菌數(shù)倍增;之后菌株進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期(60 ～84 h)，通常在此時(shí)期，大多數(shù)細(xì)菌開(kāi)始進(jìn)行一系列的次級(jí)代謝反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量的次生代謝物(如抗生素、乳酸等)，因此此時(shí)期又可以被稱(chēng)作代謝產(chǎn)物合成期，一般在生產(chǎn)實(shí)踐中穩(wěn)定期的生長(zhǎng)規(guī)律具有重要的指導(dǎo)意義;繼續(xù)培養(yǎng)84 h 以后，菌株的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，個(gè)體死亡速度超過(guò)新生速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)。

根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，試驗(yàn)中將種子培養(yǎng)液以2%的接種量接入裝有100 mL 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 容量三角瓶中，在前面篩選的最佳發(fā)酵條件下分別培養(yǎng)42，48，54，60，66，72，78，84 h，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間段內(nèi)發(fā)酵液中的酶活力，以確定最佳發(fā)酵周期，結(jié)果見(jiàn)圖15。

圖15 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.15 The effect of fermentation time on enzyme production

由圖15 可知，在菌株發(fā)酵培養(yǎng)的開(kāi)始階段，發(fā)酵所產(chǎn)的普魯蘭酶活力較低，但是隨著菌體大量生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵液中所產(chǎn)生的普魯蘭酶酶活力也隨著菌體細(xì)胞數(shù)量的增加而不斷地增大，在發(fā)酵60 h 以后，菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)酶活仍然呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，直到在發(fā)酵72 h 時(shí)，發(fā)酵液中的酶活力達(dá)到最大，此后酶活力略有下降。

2.3.8 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 菌體接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖16。

圖16 菌體接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.16 The effect of amount of inoculation on enzyme production

由圖16 可知，當(dāng)菌體的接種量小于8%時(shí)，發(fā)酵液中普魯蘭酶酶活會(huì)隨著接種量的增大而增高;接種量8%時(shí)，發(fā)酵液中的普魯蘭酶酶活達(dá)到最高，繼續(xù)增大接種量，酶活力呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榻臃N量的高低會(huì)影響到接種后微生物在培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的速率，從而影響菌株發(fā)酵產(chǎn)酶。當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，菌體細(xì)胞密度小，菌體生長(zhǎng)繁殖緩慢，發(fā)酵遲緩，產(chǎn)酶受限;當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，由于菌體數(shù)量太大，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量消耗過(guò)快，容易造成培養(yǎng)環(huán)境缺氧和菌體過(guò)快衰老，從而不利于代謝產(chǎn)物酶的積累。因此，選擇接種量8%(V/V)為最適接種量。

2.3.9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖17。

圖17 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.17 The effect of shaker speed on enzyme production

由圖17 可知，菌株AI-1 發(fā)酵液中的普魯蘭酶酶活隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大而增高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速150 r/min 時(shí)，酶活達(dá)到最大;之后，隨著搖床轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大，酶活略有下降，但基本趨于穩(wěn)定。其原因是當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/min 時(shí)，發(fā)酵液中溶液氧的濃度已經(jīng)能夠滿(mǎn)足菌體的生長(zhǎng)需求，即達(dá)到了溶解氧的供需平衡。因此，菌株AI-1 發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速確定為150 r/min。

綜上所述，菌株AI-1 的最適培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為:可溶性淀粉1.5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，MgSO4·7H2O 0.05%，培養(yǎng)溫度36 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，接種量8%(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵周期72 h。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，對(duì)菌株AI-1 進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶酶活測(cè)定，重復(fù)3 次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 優(yōu)化條件下菌株AI-1 的產(chǎn)酶酶活Table 2 The enzyme activity produced by strain AI-1 under optimal conditions

由表2 可知，通過(guò)對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)及成分的調(diào)整與發(fā)酵條件的優(yōu)化［23］，菌株AI-1 所產(chǎn)普魯蘭酶酶活力由最初的2.35 U/mL 提高到了4.52 U/mL。

3 結(jié)論

從甘肅省定西市境內(nèi)某淀粉加工廠附近的土壤中分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶優(yōu)勢(shì)酶源菌AI-1，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及16S rRNA 序列鑒定并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，最終鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其最佳產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為:可溶性淀粉1.5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%;最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度36 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，接種量8%(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵周期72 h。在此優(yōu)化條件下，菌株AI-1 發(fā)酵所產(chǎn)普魯蘭酶的酶活由最初的2. 45 U/mL 提高到4.52 U/mL，酶活提高84.5%，為我國(guó)淀粉加工工業(yè)的酶制劑生產(chǎn)提供了新的菌種資源，并為傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑工藝的現(xiàn)代化改造和技術(shù)升級(jí)提供理論依據(jù)和參考。

［1］ 馬海蓉，李艷，高文慧，等. 普魯蘭多糖生產(chǎn)菌種及其在農(nóng)產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用［J］. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，17(2):124-128.

［2］ Kang Jinho，Kyung-Min Park，Kyoung-Hwa Choi，et al.Molecular cloning and biochemical characterization of a heat-stable type I Pullulanase from Thermotoga neapolitana［J］. Enzyme and Microbial Technology，2011，48:260-266.

［3］ Monika Doman-Pytka，Jacek Bardowski. Pullulan degrading enzymes of bacterial origin［J］.Critical Review in Microbiology，2004，30:107-121.

［4］ 程景偉，景建洲，楊雪鵬，等. 普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化與酶學(xué)性質(zhì)研究［J］. 廣東化工，2012，39(6):37-39.

［5］ Brock T D，F(xiàn)reeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp.n.a nonsporulating extreme thermophile［J］. Journal of Bacteriology，1969，98(1):289-297.

［6］ Gantelet H，Duchiron F. Purification and properties of a thermoactive and thermostable Pullulanase from Thermococcus hydrothermalis，a hyperthermophiles archaeon isolated from a deep-sea hydrothermalvent［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1988，49:770-777.

［7］ Ohba R，Chaen H，Hayashi S，et al. Immobilization of streptomyces flavochromogenes pullulanase on tannic acid and TEAE-cellulose［J］. Biotechnol Bioeng，1987，20(5):665-676.

［8］ Bertolado C，Armbrecht M，Becker F，et al. Cloning，sequencing，and characterization of a heat-and alkali-stable type I Pullulanase from Anaerobranca gottschalkii［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(6):3407-3416.

［9］ Konishi Y，Amemura A，Tanabe S，et al. Immunological study of Pullulanase from klebsiella strains and the occurrence of this enzyme in the enterobacteriaceae［J］. Int J Syst Bact，1979，29(1):13-18.

［10］Suzuki Y，Hatagaki K，Oda H，et al.A hyperthermostable pullula-nase produced by an extreme thermophile，Bacillus flavocadarius KP1228，and evidence for the proline theory of increasing protein thermostability［J］. Appl Microbiol Biotechnol，1991，34:707-777.

［11］ Rudiger A，Jorgenson P L，Antranikian G，et al. Isolation and characterization of a heat-stable Pullulanase from the hyperthermophilic archaeon Purococcus woesei after cloning and expression of its gene in E.coli［J］.Appl Environ Microbiol，1995，61:567-575.

［12］Bongaerts R J M，Heinz H P，Hadding U，et al.Antigenicity，expression，and molecular characterization of surfacelocated pullulanase of Streptococcus pneumoniae［J］.Infec Immunity，2000，68(12):7141-7143.

［13］朱夢(mèng)，孫海彥，彭明.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與發(fā)酵條件的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(7):136-140.

［14］Saha B C，Lamed R，Lee C Y，et al.Characterization of an endo-acting amylopullulanase from Thermoanaerobacter strain B6A［J］. Appl Environ Microbiol，1990，54(4):881-886.

［15］Brown S H，Kelly R M.Characterization of amylolytic enzymes，having both α-1，4 and α-1，6 hydrolytic activity，from the Thermophilic Archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59(8):2614-2621.

［16］Suzukl Y，Hataga K I，Oda H.A hyperthermostable Pullulanase produced by an extreme thermophile，Bacillus flavocaldarius KP 1228，and evidence for the proline theory of increasing protein thermostability［J］. Appl Environ Microbiol，1991，34(6):707-714.

［17］馬向東，柯濤，熊蘭，等.一種鑒定多糖水解酶類(lèi)及其產(chǎn)生菌的新方法［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47(6):1102-1104.

［18］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［19］R.E.布坎南，N.E.吉布斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.8版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京:科學(xué)出版社，1984.

［20］宋勇強(qiáng).甘肅傳統(tǒng)釀造食醋中醋酸菌多樣性研究及優(yōu)良醋酸菌的篩選［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［21］喬宇，丁宏標(biāo)，閆俊艷，等.一株普魯蘭酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2012，14(4):81-86.

［22］魏炳卓，孫杰，王晶，等.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 化學(xué)與生物工程，2008，25(10):35-38.

［23］宋勇強(qiáng)，贠建民，安志剛，等.基于正交設(shè)計(jì)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的醋酸菌A3 菌株醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(5):142-150.