常 成， 靳 鵬， 鄭 薇， 康華利， 鄧夢楊， 李雙菲， 武曉靜

(第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍心血管病研究所，重慶 400037)

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野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓時對肺血管壁Jagged2/Notch3信號分子表達的影響*

常 成， 靳 鵬， 鄭 薇， 康華利， 鄧夢楊， 李雙菲， 武曉靜△

(第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍心血管病研究所，重慶 400037)

目的： 觀察野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓時肺血管壁Jagged2/Notch3信號分子表達的變化，探討Jagged2/Notch3信號在肺動脈高壓發(fā)生中的作用和意義。方法: 45只SD大鼠隨機分為正常對照組(C組)、溶劑對照組(S組)和野百合堿模型組(M組)，每組15只，通過一次性腹腔注射野百合堿50 mg/kg建立肺動脈高壓模型，溶劑對照組注射相同劑量的溶媒。4周時通過HE染色觀察肺血管重構，通過右心導管測定平均肺動脈壓(mPAP)和右心室收縮壓(RVSP)。采用免疫組化和實時熒光定量PCR等方法檢測肺血管壁Jagged2/Notch3/Hes5蛋白和mRNA表達的變化。結果: 與正常對照和溶劑對照組相比，4周時野百合堿模型組的血管壁顯著增厚，中膜厚度百分比增加(P<0.01)；此外野百合堿模型組的mPAP和RVSP顯著高于正常對照和溶劑對照組(P<0.01)；免疫組化和實時熒光定量PCR結果提示Jagged2主要表達于肺小動脈內膜，Notch3、Hes5主要表達于肺小動脈中層平滑肌，與溶劑對照組以及正常對照組相比，野百合堿模型組肺小動脈的Jagged2、Notch3和Hes5表達顯著增高。結論: Jagged2/Notch3信號分子的激活可能在野百合堿誘導肺動脈高壓發(fā)生中起重要作用。

肺動脈高壓; 肺血管重構; 野百合堿; Jagged2/Notch3信號分子

肺動脈高壓以肺血管阻力進行性增高為主要特點，是一種涉及多種病因的肺血管疾病。然而，臨床上引起肺動脈高壓的病因雖多，但不論何種原因引起的肺動脈高壓，均以肺血管重構為基本病理基礎，且肺血管重構是不同病因觸發(fā)肺動脈高壓形成后，肺動脈高壓得以維持并迅速進展的共同機制[1]。

已有研究表明，Notch信號影響胚胎血管動靜脈分化和成體血管重構，是調節(jié)血管形態(tài)結構改變的基本信號機制之一[2]。Li等[3]和Thistlethwaite等[4]發(fā)現多種病因導致肺動脈高壓發(fā)生時，肺血管平滑肌Notch3表達增強，提示Notch3信號可能在肺血管重構中起重要作用，但其激活機制不清。參與Notch信號調節(jié)的配體有Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4，有研究發(fā)現缺氧使肺動脈內皮的Jagged2表達選擇性升高[5]，我們推測Notch3可能被Jagged2激活，在肺動脈高壓發(fā)生中起重要作用。本實驗擬通過觀察野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓時肺血管壁Jagged2/Notch3信號分子表達變化，探討Jagged2/Notch3信號在肺動脈高壓發(fā)生中的作用和意義。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、主要試劑和儀器

6～8周齡雄性SD大鼠45只，體重180～200 g，購自第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院新橋醫(yī)院實驗動物中心。

野百合堿(monocrotaline，MCT)購自Sigma；免疫組化染色試劑盒、PBS 液(北京中杉金橋生物技術有限公司)； Total RNA提取試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR? Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)；兔抗大鼠Notch3和Hes5多克隆抗體購自Abcam；兔抗大鼠Jagged2多克隆抗體購自Santa Cruz；PowerLab八通道生理記錄儀(澳大利亞AD儀器國際貿易上海有限公司)；實時熒光定量PCR測定儀(ABI)；核酸蛋白檢測儀(Coulter)；冰凍切片機(Leica)；倒置相差顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 肺動脈高壓模型的建立和分組 野百合堿用乙醇和生理鹽水(2∶3)配制成1%的水溶液使用[6]。將45只大鼠隨機分為正常對照組(C組)，溶劑對照組(S組)，野百合堿模型組(M組)；所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng), 飲食條件相同。實驗大鼠飼養(yǎng)在重慶新橋醫(yī)院動物中心, 光照12 h明暗交替。模型組一次性腹腔內注射MCT 50 mg/kg；溶劑對照組注射同等劑量的溶劑；正常對照組不做任何處理，大鼠常規(guī)給予食物和水，飼養(yǎng)4周，4周后空氣栓塞法處死大鼠。

2.2 觀測指標及檢測方法 血流動力學監(jiān)測：野百合堿注射后第4周，記錄大鼠體重，測定其平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。大鼠經濃度為2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后, 將導管插入右頸外靜脈, 緩慢進入右心房, 導管內加入肝素鹽水，由壓力傳感器連至多導生理記錄儀，依據計算機屏幕顯示的圖像和波幅的變化, 區(qū)別導管尖端所處的位置，根據壓力波形觀察測定mPAP和RVSP。記錄數據后利用栓塞法處死大鼠, 分離出右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)及室間隔(septum ventriculorum，S)，用濾紙吸去血液、鹽水，分別稱量RV和LV+S的重量，RV/(LV+S)即為右心肥大指數(RVI)。

2.3 肺組織取材 配制冰生理鹽水，完成肺動脈壓測量后,由肺動脈灌洗肺血管中的血液，用眼科彎鑷沿肺動脈主干迅速剝離出肺動脈主干和肺內部分動脈，取下的組織標本立即置入液氮中凍存以備目的基因和蛋白檢測，后取出左肺下葉外側部分并用4%多聚甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋后切片(5 μm)，用于HE染色和蛋白免疫組織化學檢測。

2.4 HE染色 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色，脫水透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺血管大體形態(tài)變化。采集圖像后采用Image Pro Plus Analysis 軟件分析，用光標勾劃出內、外彈力板的輪廓，分別測定內、外彈力板的平均直徑，計算內、外彈力板之間的厚度為肺小動脈的中膜厚度(wall thickness，WT)和血管的外彈力板的平均直徑(external diameter，ED)。根據公式計算中膜厚度百分比：WT%=(2×WT/ ED)×100% 。

2.5 Real-time PCR 所用引物由Primer 5.0軟件設計，TaKaRa生物技術有限公司合成，序列見表1。RNAiso Plus提取總RNA，20 μL 體系中進行反轉錄，50 μL 體系中進行擴增。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書提供的方法進行逆轉錄，再以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增采用兩步法,條件如下：95 ℃ 30 s；然后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共45個循環(huán)。反應完成后，得到所有標本的記錄曲線。軟件將自動進行數據分析，調整基線，計算出Ct值。相對定量公式及表達量計算按文獻所述[7]。

表1 Jagged2、Hes5、Notch3 和 GAPDH的引物序列

2.6 免疫組織化學實驗 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加30 g/L過氧化氫，室溫下濕盒中封閉12 min, 以消除內源性過氧化物酶活性，0.1 mol/L PBS洗片5 min 3次, 正常山羊血清工作液封閉，室溫下孵育30 min，甩去血清，不洗，滴加1∶100稀釋的多克隆 I 抗，4 ℃孵育過夜，0.1 mol/L PBS洗片5 min 3次；滴加生物素標記的 II 抗工作液，37 ℃孵育40 min，PBS洗片5 min 3次；滴加辣根酶標記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育40 min，PBS洗片5 min 3次；DAB顯色劑顯色1～2 min，蘇木精復染，脫水透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺動脈Jagged2/Notch3和Hes5的表達結果。

3 統(tǒng)計學處理

所有數據應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析。右心肥厚指數(RVI)和中膜厚度百分比(WT%)的相關性采用Pearson線性相關分析。

結 果

1 肺動脈高壓模型大鼠變化

4周時，正常組及溶劑組大鼠體重增加，毛發(fā)光澤，反應靈敏；模型組注射MCT后，大鼠逐漸出現毛發(fā)暗淡無澤、皮膚瘀斑、活動減少、呼吸急促、肝腹腫大、體重減輕和反應遲鈍等表現。實驗動物死亡情況：模型組于實驗第2 天、第20 天及第24 天各死亡1只。在進行血流動力學檢測時，正常組1只大鼠因心律失常死亡；溶劑組2只大鼠因麻醉意外中死亡，余均完成了肺動脈壓力的檢測。最終模型組12只，溶劑組13只，正常組14只。

2 肺血流動力學的各項指標變化

注射MCT 4周后，大鼠肺動脈高壓模型成功建立，模型組mPAP、RVSP、RVI、WT%等指標均較正常對照組和溶劑對照組明顯升高(P<0.01)，見圖1、表2。另外作RVI和WT%相關性分析顯示相關性具有統(tǒng)計學意義。可以認為右心肥厚變化和血管中膜肥厚間存在相關關系。

Figure 1.The pulmonary hemodynamics in the rats with MCT treatment for 4 weeks. Mean±SD. n=12～14.**P <0.01 vs C and S．

表2 正常組、溶劑組及MCT組大鼠RVSP、mPAP、RVI、WT%的比較

**P<0.01vscontrol group and solvent group.

3 病理學觀察HE染色

取大鼠肺組織進行HE染色，可見正常組及溶劑組管壁較薄，管腔通暢，未見狹窄。與正常組及溶劑組相比，模型組中小肺動脈血管內皮層明顯增生，中膜明顯增厚，平滑肌細胞增生，內、外彈力纖維層均明顯增厚，管腔縮小，部分無肌型血管肌化現象嚴重，甚至可見血管腔完全閉塞等血管叢樣改變，見圖2。

4 免疫組化定位定量分析蛋白表達

免疫組織化學檢測正常組及溶劑組小動脈血管內膜可見少量Jagged2表達，中膜平滑肌層也可見少量的Notch3、Hes5表達。與正常組及溶劑組相比，模型組中小動脈Jagged2、Notch3、Hes5表達均明顯增高，Jagged2主要表達于小動脈血管內膜，Notch3、Hes5主要表達于小動脈平滑肌層。另外血管壁周邊的肺泡組織部分也可見少量的Jagged2、Notch3、Hes5表達，見圖2。

5 熒光定量PCR分析mRNA表達

核酸檢測儀檢測RNA純度，A260/A280比值為1.80～2.00，表明RNA純度較高。采用real-time PCR檢測大鼠肺血管及組織中Jagged2、Notch3及Hes5 的mRNA表達，以GAPDH作為內參照，C、S、M組Notch3基因相對表達量分別為0.992±0.038、0.998 ±0.001、1.708±0.133；Jagged2基因平均相對表達強度分別為0.992±0.016、0.998±0.001、10.270±0.254；Hes5基因平均相對表達強度分別為0.982±0.016、0.998±0.001、1.803 ±0.278。圖中顯示模型組肺血管及部分組織中Jagged2、Notch3、Hes5的 mRNA相對表達量顯著高于溶劑組和正常組(P<0.01)，溶劑組和正常組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討 論

肺高血壓病因多樣，遺傳、基因變異、缺氧、左心疾病、血栓栓塞等多種原因均可引起肺動脈高壓，其發(fā)病機制復雜，涉及基因變異、炎癥、離子通道、多種信號轉導通路等多種機制[8]。近年發(fā)現Notch信號通路可能在肺高血壓發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實驗通過MCT腹腔注射法建立肺高血壓模型，發(fā)現4周時,大鼠肺動脈壓力顯著升高,出現顯著的肺小動脈增厚和右心室肥厚, 說明肺高血壓大鼠模型建立成功。通過免疫組化和實時熒光定量PCR等方法發(fā)現，模型組大鼠和兩對照組大鼠肺組織及血管都有Jagged2、Notch3和Hes5的表達，且Jagged2主要表達于血管內膜，Notch3 、Hes5主要表達于血管中層。與對照組相比，MCT誘導的肺高壓大鼠肺組織及血管Jagged2、Notch3 和Hes5的表達顯著增高。

Notch信號是一個分化保守的跨膜信號通路, 通過其細胞內的信號通路級聯影響細胞分化、增殖和凋亡，最終決定細胞命運，影響器官形成和形態(tài)發(fā)生等[9]。其中在肺發(fā)育過程中，對調控肺泡上皮的分化發(fā)育起關鍵作用[10]。本研究中我們也發(fā)現肺小動脈周邊的肺泡部分也可見到Notch信號分子的表達。在哺乳動物存在4種Notch受體，即Notch 1、2、3、4。Notch受體的跨膜蛋白由胞外段、跨膜段和膜內段組成。Notch3基因是在哺乳動物中發(fā)現的第3個Notch家族成員，其明顯區(qū)別于其它Notch家族成員在于胞內段的轉錄激活區(qū)(transactivation domain, TAD)，相比Notch1、2, 其TAD段更短，轉錄激活性能較弱，因此命名為Notch3基因。起初發(fā)現其主要表達在增殖的神經上皮細胞上[11]，后來發(fā)現Notch3也表達在哺乳動物的血管系統(tǒng)。作為重要的信號受體蛋白，Notch3特異性表達于成熟的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)，參與血管發(fā)生及分化，在小動脈發(fā)育和形成時調節(jié)VSMCs的分化與成熟，在病理狀態(tài)下調節(jié)VSMCs的表型轉化參與血管重構。研究發(fā)現Notch3主要通過Hes5途徑介導肺動脈平滑肌增殖和肺血管重構，并且肺動脈高壓的嚴重程度與肺血管Notch3/Hes5活化和Notch3、Hes5蛋白表達量呈正相關[12-13]。鼠的胚胎期缺失Notch3將會導致血管平滑肌缺失和血管壁變薄。Notch3信號通路不僅控制著肺動脈平滑肌細胞的分化增殖，而且維持著使平滑肌細胞在一個未分化狀態(tài)。例如，應用γ分泌酶抑制劑N-S-苯基甘氨酸丁酯特異性阻斷肺血管平滑肌Notch3信號通路，可成功逆轉肺動脈高壓；同時，Hes5和Notch3基因沉默小鼠不會出現肺動脈高壓，而高表達的Notch3增強了平滑肌細胞的增殖。目前研究發(fā)現，Notch的配體有5種, 即Delta-like 1、3、4 和Jagged-1、2[14]。Delta-like與Jagged 均為單次跨膜糖蛋白，都屬于Deha，Serrate，Lag-2(DSL)蛋白家族，與Delta-like不同，Jagged胞外區(qū)還有1個富含半胱氨酸的區(qū)域(cysteinerich，CR)，Delta-like無CR區(qū)。Jagged2有16個EGF樣重復區(qū)，Delta1、Delta3和Delta4分別具有8、6及8個EGF樣重復區(qū)[15]。其通過與Notch受體胞外段富含表皮生長因子樣重復片段結合發(fā)揮效應,從而調節(jié)細胞和組織生成，維持機體正常生理功能，病理條件下參與炎癥過程，調控腫瘤發(fā)生發(fā)展[16]。Notch與配體結合后，在其跨膜區(qū)有一金屬蛋白酶作用位點，切割下來的胞外段將被表達配體的細胞內吞消化分解；跨膜區(qū)近胞內段有γ-secretase作用位點，釋放Notch胞內段(Notch intracellular domain，NICD)。NICD轉移到細胞核，與CBF-1異二聚體化，調控相應基因表達，影響細胞生物學行為[17]。經典的Notch信號是通過側抑制的方式調節(jié)相鄰細胞的活動，近來發(fā)現在血管壁其主要通過改變血管細胞自分泌或旁分泌的方式參與血管結構和功能的調節(jié)[18]。

Figure 2.Pathologic morphology and protein expression of Jagged2, Notch3 and Hes5 in the rats. Mean±SD. n=12～14. **P<0.01 vs C and S.

然而，在肺循環(huán)疾病和肺動脈高壓進展過程中，Notch3是被何種配體激活的目前尚未見相關報道。有研究表明缺氧引起的肺血管重構時缺氧使肺血管內皮Jagged2表達特異性升高。在本實驗中，同樣MCT誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管Jagged2和Notch3表達明顯增高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。這些結果表明Jagged2/Notch3-Hes5信號分子可能在MCT誘導的肺動脈高壓大鼠模型肺血管重構中具有重要作用。兩者的協(xié)同高表達可能誘發(fā)了內皮和平滑肌細胞的增殖，進而促進了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。Shimizu等[19]采用細胞結合分析法在實驗中證明Jagged2是Notch3的配體，有激活Notch3的作用，提示在肺動脈高壓的發(fā)生過程中，肺動脈內皮細胞Jagged2表達升高，可能通過刺激或抑制內皮細胞分泌活性物質，進而激活肺動脈平滑肌細胞Notch3/Hes5信號，最終促進肺動脈平滑肌表型轉換和肺血管重構，導致肺高血壓的發(fā)生。此外，Jagged2在激活Notch3的過程中是否與其它受體Notch3、Notch4和配體Jagged1，Delta1、2、3有交叉聯系，它們如何參與肺動脈高壓的發(fā)生過程，以及Jagged2對Notch3可能的激活效應是否在其它病因形成肺高血壓的發(fā)病機制中也起一定的作用，仍不清楚，尚需進一步研究。

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Expression of Jagged2/Notch3 signaling molecules in pulmonary hypertensive rats induced by monocrotaline

CHANG Cheng, JIN Peng, ZHENG Wei, KANG Hua-li, DENG Meng-yang, LI Shuang-fei, WU Xiao-jing

(CardiovascularInstituteofXinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China.E-mail:xiaojingwu1992@163.com)

AIM: To study the expression of Jagged2/Notch3 signaling molecules in pulmonary vascular wall of pulmonary hypertensive rats induced by monocrotaline. METHODS: SD rats were randomly divided into normal control group (C group,n=15), solvent control group (S group，n=15) and monocrotaline model groups (M group，n=15). The model of pulmonary hypertension was established by a single subcutaneous injection of monocrotaline (50 mg/kg). The rats in S group were given a single subcutaneous injection of the same dose of solvent. After 4 weeks, the pulmonary vascular remodeling was assessed by HE staining, and the mean pulmonary artery pressure (mPAP) and right ventricular systolic pressure (RVSP) were determined by right heart catheterization. The expression of Jagged2/Notch3 /Hes5 molecules in the pulmonary vascular wall was detected by immunohistochemical method and real-time PCR. RESULTS: Compared with S group and C group, the percentage of medial wall thickness of smaller arteries in model group increased significantly (P<0.01). The levels of mPAP and RVSP in M group were significantly higher than those in S group and C groups (P<0.01). The results of real-time PCR showed that the expression of Jagged2, Notch3 and Hes5 was significantly increased in M group compared with S group and C group. The data from immunohistochemical detection indicated that Jagged2 mainly expressed in the intima of small lung artery, Notch3 and Hes5 mainly expressed in the medial smooth muscle cells. Compared with S group and C group, the expression of Jagged2 and Notch3 was significantly increased in the lung small arteries of M group. CONCLUSION: The activation of Jagged2/Notch3 signaling pathway might play an important role in the formation of pulmonary hypertension.

Pulmonary hypertension; Pulmonary vascular modeling; Monocrotaline; Jagged2/Notch3 signaling molecule.

1000- 4718(2015)01- 0012- 06

2014- 09- 11

2014- 11- 12

國家自然科學基金資助項目(No. 81270109；No. 30872710)

△通訊作者 Tel： 23-68774559； E-mail: xiaojingwu1992@163.com

R541.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.003