張海峰，周建峰

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

抑癌基因von Hipplel－Lindau（VHL）得名于一類十分罕見(jiàn)的家族性顯性遺傳病——VHL綜合征，該病病人罹患腫瘤的概率顯著升高［1］。VHL基因定位在人類3號(hào)染色體短臂上（3p25－p26），包含3個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由213個(gè)氨基酸組成的蛋白［2］。VHL蛋白的缺失與VHL綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。距VHL基因首次被鑒定和克隆已經(jīng)有20多年的時(shí)間，到目前為止對(duì)VHL功能的研究也已經(jīng)比較深入，VHL最廣為人知的功能當(dāng)屬它作為E3泛素化連接酶復(fù)合體的一個(gè)組分促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基（HIF1α）的降解。而von Hippel－Lindau binding protein 1（VBP1）最早是作為抑癌因子VHL的結(jié)合蛋白被鑒定出來(lái)的，并因此而得名。同時(shí)，它還是前折疊素（PFD）異源六聚體的一個(gè)組成亞基，稱為PFD3。VBP1作為PFD的一個(gè)亞基可以幫助新合成的多肽與其分子伴侶結(jié)合以完成翻譯后的折疊［3］。

1 VHL綜合征及腫瘤抑制因子VHL的功能

1.1 VHL綜合征

VON等［4］和 LINDAU［5］在20世紀(jì)初期首先對(duì) VHL綜合征進(jìn)行了描述，VON描述了一個(gè)視網(wǎng)膜血管瘤患病率很高的家族，而LINDAU［5］報(bào)道這些視網(wǎng)膜腫瘤通常出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變處的附近。該疾病也因此得名于二人的名字組合?，F(xiàn)在已經(jīng)知道VHL綜合征是一種可遺傳的腫瘤征候群，目前，該病發(fā)病率約為1／35000。VHL疾病的病人體內(nèi)良性腫瘤的發(fā)生率明顯升高，腫瘤主要出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（成血管細(xì)胞瘤）、視網(wǎng)膜（血管瘤）及腎上腺（嗜鉻細(xì)胞瘤）等部位。此外，許多病人還會(huì)產(chǎn)生腎臟惡性腫瘤——腎透明細(xì)胞瘤（ccRCC）［6］?，F(xiàn)已證明VHL綜合征的出現(xiàn)是由VHL基因的胚系突變引起的。根據(jù)不同的患病類型對(duì)VHL綜合征病人進(jìn)行分類，1型病人表現(xiàn)為患血管母細(xì)胞瘤，但患嗜鉻細(xì)胞瘤和ccRCC的概率較低，2型病人同樣患血管母細(xì)胞瘤，且患嗜鉻細(xì)胞瘤的概率也很高，2型病人又可以被細(xì)分為2A（患ccRCC概率低）、2B（患ccRCC概率高）和2C（不患ccRCC）［6］。VHL蛋白不同位置的突變能提高特定類型腫瘤的患病概率，這也支持VHL蛋白作為腫瘤抑制因子功能多樣的主張。

1.2 VHL蛋白的功能

1.2.1 VHL是E3泛素化連接酶的一個(gè)組分 VHL蛋白沒(méi)有酶活性，但它能夠與許多其他蛋白結(jié)合從而發(fā)揮功能。蛋白質(zhì)的泛素化需要由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2以及泛素連接酶E3共同作用完成。VHL能夠與elongins B、elongins C、cullin 2 以 及 Rbx－1 形 成 elongin／cullin／VHL（ECV）復(fù)合體［7－8］，其結(jié)構(gòu)和功能 類似于 酵母中的 Skp1／Cdc53／F－box蛋白（SCF）多重復(fù)合體，具有E3泛素化連接酶活性，能使蛋白質(zhì)底物泛素化。在ECV復(fù)合體中VHL作為底物識(shí)別亞基發(fā)揮作用［9］。轉(zhuǎn)錄因子－HIF家族是VHL介導(dǎo)的泛素化蛋白中被研究最廣泛可能也是最重要的一種底物蛋白［10］。ECV復(fù)合體通過(guò)VHL的β－結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合羥基化的 HIF1α，VHL E3泛素化連接酶通過(guò)與HIF1α氧依賴降解（ODD）結(jié)構(gòu)域的核心部位物理結(jié)合從而對(duì)HIF1α進(jìn)行泛素化修飾，泛素化的HIF1α?xí)杆偻ㄟ^(guò)26S蛋白酶體途徑降解［11］。除了HIF1α之外，ECV復(fù)合體還有其他一些靶蛋白，包括蛋白激酶C（PKC）［12］及過(guò)度磷酸化的Rpb1［13］等。有研究表明，PKC在調(diào)節(jié)c－Jun依賴的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中具有重要作用，而后者是嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞潛在的前體［14］。Rpb1是RNA聚合酶Ⅱ的一個(gè)亞基，RNA聚合酶Ⅱ會(huì)在紫外輻射后被激活，與壓力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)［13］。當(dāng)然，并不是所有的蛋白與VHL結(jié)合都會(huì)發(fā)生泛素化，相反有某些VHL突變與一些泛素化功能正常的腫瘤發(fā)生有關(guān)，其中也包括HIF1α泛素化正常的情況。例如，2C型的VHL疾病病人HIF1α的泛素化并無(wú)異常，但他們出現(xiàn)嗜鉻細(xì)胞瘤的可能性仍顯著升高［15］。所以，類似于2C型病人的VHL突變促進(jìn)腫瘤發(fā)生可能不依賴于ECV復(fù)合體和HIF的功能。對(duì)VHL除介導(dǎo)蛋白泛素化外的其他功能進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該蛋白的功能多樣。

1.2.2 VHL參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的調(diào)節(jié) 有研究證明，VHL能夠協(xié)助ECM的調(diào)控，在ECM環(huán)境中VHL的缺失能夠使血管更容易浸潤(rùn)到腫瘤中從而促進(jìn)血管的生成。VHL及纖連蛋白能夠與整合素相互作用，從而共同調(diào)控ECM［16］。VHL缺失的細(xì)胞中纖連蛋白的分泌量有所升高，但是作為ECM的一部分，它的組裝是紊亂的，而在這些細(xì)胞中重新引入野生型的VHL能夠使之恢復(fù)正常［17］。因此，VHL和纖連蛋白的相互作用缺失會(huì)導(dǎo)致ECM生成的缺陷。近期有報(bào)道稱在VHL缺失的腎癌細(xì)胞中ECM的缺陷與RhoA GTPase活性的降低有關(guān)［17］。VHL還能夠與膠原蛋白IVα2（COL4α2）結(jié)合［18］，VHL缺失能夠使 COL4α2從ECM中消失［19］，從而使VHL缺失的腫瘤進(jìn)一步解除對(duì)ECM結(jié)構(gòu)的控制。

1.2.3 VHL參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控 有證據(jù)表明，VHL的功能還涉及對(duì)凋亡調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，包括腫瘤抑制因子p53、核因子－κB（NF－κB）以及轉(zhuǎn)錄因子E2F1。p53與多種腫瘤如子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。在正常情況下，作為對(duì)DNA損傷或是其他刺激的應(yīng)答，p53能夠促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。ROBERTS等［21］證明在ccRCC中，伴隨VHL缺失導(dǎo)致的HIF2α穩(wěn)定能夠促進(jìn)Hdm2對(duì)p53的抑制作用，這也是VHL調(diào)控細(xì)胞存活的一種可能的作用機(jī)制。另外，VHL缺失能夠使NF－κB的活性升高。NF－κB活性升高能通過(guò)激活抗凋亡及增殖信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，其在胰島細(xì)胞凋亡及胰島素抵抗中的作用也受到廣泛重視［22］。在正常情況下VHL能結(jié)合酪蛋白激酶2（CK2）并促進(jìn)Card9的磷酸化，而磷酸化的Card9是NF－κB的激動(dòng)劑，據(jù)此研究人員提出了伴隨Card9磷酸化的增強(qiáng)（通常伴隨VHL的缺失）NF－κB的活性也隨之增強(qiáng)的作用機(jī)制［21］。而在VHL缺失的ccRCC細(xì)胞中抑制Card9能使NF－κB的活性恢復(fù)正常，進(jìn)一步證明了這種機(jī)制的可靠［21］。此外，WANG等［23］最近研究證實(shí)，VHL能夠與雄激素受體（AR）相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄活性并抑制雄激素受體誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，但VHL并沒(méi)有誘導(dǎo)雄激素受體的泛素化降解。

2 VHL結(jié)合蛋白VBP1及PFD復(fù)合體

2.1 PFD的結(jié)構(gòu)和功能

在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中，許多蛋白需要在一個(gè)或多個(gè)分子伴侶家族成員的幫助下完成正確折疊從而變成有活性的天然蛋白［24］。在眾多分子伴侶中，伴侶蛋白是十分重要的一類，在所有已知的物種中均能找到伴侶蛋白的存在。伴侶蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能還需要其他分子伴侶的幫助。例如，PFD通過(guò)將未折疊的蛋白傳送到伴侶蛋白空腔內(nèi)而幫助古細(xì)菌和真核生物中的Ⅱ型伴侶蛋白發(fā)揮功能［3］。PFD最早是在對(duì)酵母的遺傳研究中被發(fā)現(xiàn)的，它廣泛地存在于古細(xì)菌及真核生物中，是一種異源六聚體蛋白。在真核生物中的PFD由6種不同的蛋白構(gòu)成，其中兩種類似于α亞基，4種類似于β亞基［3］。

有研究證實(shí)，真核生物的PFD能選擇性地結(jié)合肌動(dòng)蛋白及微管蛋白，之后PFD能特異結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的伴侶蛋白CCT并將底物蛋白傳遞給它，以完成后續(xù)的折疊組裝［25］。因?yàn)橛薪z分裂的細(xì)胞對(duì)微管蛋白的需求量很大，所以在秀麗隱桿線蟲中刪除PFD對(duì)其胚胎是致死的［26］。在酵母中刪除PFD并不會(huì)致死，但也會(huì)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，且具有細(xì)胞骨架缺陷的表型特點(diǎn)［3］?？紤]到PFD是一種異源六聚體，SIMONS等［27］假設(shè)PFD 6個(gè)不同的亞基對(duì)其與肌動(dòng)蛋白及微管蛋白的結(jié)合貢獻(xiàn)也是不同的，因此他們將PFD各亞基的卷曲螺旋觸手頂端分別刪除，構(gòu)建了單個(gè)亞基有缺陷的雜合體PFD。正如預(yù)期，截短PFD3和PFD4能夠消除PFD與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，而截短PFD4和PFD 5能夠消除PFD與微管蛋白的結(jié)合［28］。盡管SIMONS等［27］并沒(méi)有直接闡明PFD卷曲螺旋觸手與底物相互結(jié)合的分子機(jī)制，但真核生物PFD能夠識(shí)別其底物并以特定方向與之結(jié)合的事實(shí)，暗示特異性結(jié)合可能是通過(guò)序列特異性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在植物中，PFD6對(duì)微管的動(dòng)態(tài)循環(huán)及結(jié)構(gòu)組織是必需的。敲除PFD1的小鼠具有明顯的細(xì)胞骨架缺陷的特點(diǎn)，包括纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)元缺失、B細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)育及功能缺陷等［29］。另外，小鼠的PFD5突變，會(huì)導(dǎo)致突變小鼠的光感受器退化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常以及雄性不育［30］。上述兩種小鼠表型的產(chǎn)生也都與纖毛及細(xì)胞骨架功能相關(guān)，由此可以得出，PFD對(duì)微管的組裝及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能都具有重要作用。

2.2 VBP1的功能

目前對(duì)于VBP1功能的研究還相對(duì)較少，主要圍繞它作為VHL結(jié)合蛋白的功能展開(kāi)。有報(bào)道稱VBP1參與了伴侶蛋白CCT介導(dǎo)的VHL與延伸因子B和C（VBC）復(fù)合體的形成［31］。而且，VBP1還能夠作為HIV－1整合酶與VHL結(jié)合的橋梁，介導(dǎo)整合酶的降解［32］。另外，VBP1被證實(shí)能夠促進(jìn)α和γ微管蛋白的形成和組裝［33］，而VHL則能夠影響微管的穩(wěn)定性［20］，這也暗示二者可能協(xié)同發(fā)揮作用。確實(shí)，在果蠅中敲除VBP1的同系物Mgr能夠降低微管蛋白的穩(wěn)定性，而當(dāng)Mgr與VHL一同敲除之后能夠部分營(yíng)救這種表型，證明VBP1可以與VHL一起調(diào)控微管蛋白的穩(wěn)定性［34］。此外，最近的研究表明，VBP1能夠與MSH4結(jié)合并促進(jìn)MSH4的泛素化，促使其通過(guò)蛋白酶體及自噬介導(dǎo)的途徑降解［35］，這也暗示VBP1可能參與到VHL介導(dǎo)的泛素化降解途徑。

3 前景與展望

一方面，目前對(duì)VHL功能以及該蛋白的缺失是如何促進(jìn)腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究已取得了巨大的進(jìn)步。不過(guò)，VHL對(duì)腫瘤的抑制作用的機(jī)制還沒(méi)有完全被闡明，VHL的新功能仍有待進(jìn)一步發(fā)掘。并且，對(duì)VHL特定的突變類型與特定腫瘤發(fā)病的升高間的聯(lián)系了解還相對(duì)較少。另外，HIF的穩(wěn)定以及轉(zhuǎn)錄激活活性升高會(huì)導(dǎo)致許多表觀遺傳學(xué)特征的改變，且過(guò)度甲基化是ccRCC的一個(gè)重要特征，也預(yù)示著VHL的缺失與表觀遺傳的改變密切相關(guān)。另一方面，目前對(duì)VBP1的研究還不夠深入，它與VHL結(jié)合之后的功能還未被確切闡明。另外，VBP1作為PFD的一個(gè)亞基，它在該復(fù)合體中的具體功能仍有待進(jìn)一步研究。不過(guò)已有一些證據(jù)支持VHL與VBP1能夠相互協(xié)作，而在該系統(tǒng)中VBP1或PFD能決定底物蛋白是被送到伴侶蛋白CCT中折疊還是經(jīng)VHL泛素化之后通過(guò)蛋白酶體途徑降解。綜上所述，繼續(xù)對(duì)VHL及其結(jié)合蛋白VBP1的功能進(jìn)行深入研究具有重要的醫(yī)學(xué)及生物學(xué)價(jià)值。

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