吳云忠，楊雪蓮，孫嘉怡

（貴州大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)550025）

1 引言

我國(guó)柑橘種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位，柑橘產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)南方主產(chǎn)區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的一大支柱產(chǎn)業(yè)［1］。由于我國(guó)南方栽培柑橘，出現(xiàn)灌溉不均一，偶遇自然災(zāi)害（旱、澇）導(dǎo)致柑橘減產(chǎn)，因此，篩選或培育抗旱性強(qiáng)，優(yōu)質(zhì)的柑橘砧木資源尤為重要。

聚乙二醇－6000（PEG）用于模擬土壤干旱來(lái)研究植物水份虧缺具有較高的實(shí)踐價(jià)值［2］。PEG－6000不易自由通過(guò)植物細(xì)胞壁，不易滲入活細(xì)胞內(nèi)，不會(huì)給植物內(nèi)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無(wú)毒，但能使活細(xì)胞緩慢吸水等優(yōu)點(diǎn)，而常被作為干旱脅迫的滲透脅迫劑［3］，已在蘋(píng)果、香蕉、棗、櫻桃、葡萄、柑橘等果樹(shù)上廣泛應(yīng)用［4～8］。李志剛等人的研究蘆筍在PEG模擬干旱條件下的生理生化變化［9］試驗(yàn)結(jié)果表明PEG可有效提高作物抗性功能表達(dá)。本試驗(yàn)以綠衣枳殼、旺蒼大葉枳為試材，研究柑橘種子在不同濃度梯度PEG模擬干旱脅迫下萌發(fā)過(guò)程中生理特性的動(dòng)態(tài)變化，為柑橘抗旱性鑒定和抗旱種質(zhì)的篩選和利用提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

以綠衣枳殼、旺蒼大葉枳種子為供試材料。綠衣枳殼采種地點(diǎn)為貴陽(yáng)市花溪區(qū)；旺蒼大葉枳種子來(lái)源于重慶農(nóng)科院柑橘研究所，采種時(shí)間為2013年10月，試驗(yàn)時(shí)間為2014年2～4月。

2.2 試驗(yàn)處理方法

選擇成熟、飽滿且大小一致的種子，經(jīng)0.50%的次氯酸鈉消毒5min，蒸餾水沖洗干凈，滅菌濾紙吸干種子表面水分后，均勻擺放在鋪有2層濾紙的90mm玻璃培養(yǎng)皿中，每皿30粒種子，分別加入6mL不同水勢(shì)的PEG－6000溶液，依據(jù) Burlyn［10］等的PEG－6000溶液配制公式，配成0%（為對(duì)照ck）、12.5%、17.6%、21.1%的PEG－6000溶液，模擬干旱條件進(jìn)行處理。綠衣枳殼的0%、12.5%、17.6%、21.1%處理分別命名為 A1、A2、A3和 A4；旺蒼大葉枳的0%、12.5%、17.6%、21.1%處理分別命名為 B1、B2、B3和 B4；于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。播種后0d、5d、10d、15d進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

2.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

α－淀粉酶、SOD、POD、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白檢測(cè)分別采用3，5－二硝基水楊酸比色法、氮藍(lán)四唑（NBT）法、愈創(chuàng)木酚法、硫代巴比妥酸法、蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)染色法，具體見(jiàn)雄慶娥編寫(xiě)的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［11］一書(shū)。

3 結(jié)果與分析

3.1 SOD酶活性的動(dòng)態(tài)變化

SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化保護(hù)酶，它直接影響著活性氧的清除，而細(xì)胞對(duì)活性氧的清除能力越強(qiáng)，則可避免植物體內(nèi)過(guò)度積累的活性氧對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞功能的傷害，因此細(xì)胞大量產(chǎn)生SOD說(shuō)明抗性越敏感。兩種枳殼種子隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶活性出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，隨著脅迫濃度的提高，SOD酶活性呈現(xiàn)不同程度提高的趨勢(shì)。在15d檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度脅迫枳殼的SOD酶活性變化最大，且綠衣枳殼的SOD酶活性比旺蒼大葉枳呈現(xiàn)顯著性差異，具體見(jiàn)圖1。種子在萌發(fā)過(guò)程中SOD酶活性也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，可見(jiàn)SOD酶也隨著種子萌發(fā)而產(chǎn)生變化。

3.2 POD酶活性的動(dòng)態(tài)變化

由圖2可知，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD酶活性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，且兩個(gè)品種間差異不大。隨著PEG脅迫的逐漸增強(qiáng)，種子內(nèi)部產(chǎn)生了過(guò)氧化物酶POD，以清除PEG脅迫中出現(xiàn)的活性氧，從而提高了種子的抗脅迫能力，低濃度短時(shí)間的脅迫更有利于POD酶活性的提高。整體比較旺蒼大葉枳產(chǎn)生的POD少于綠衣枳殼。

3.3 MDA含量的動(dòng)態(tài)變化

植物脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)物丙二醛（MDA）是檢測(cè)植物細(xì)胞傷害的一個(gè)重要指標(biāo)，它的含量高低反映植物細(xì)胞膜的傷害程度［12］。從圖3可看出，兩個(gè)枳殼種子隨著PEG脅迫時(shí)間的加深，MDA含量基本保持直線增加趨勢(shì)。而綠衣枳殼在同一時(shí)間、同一脅迫濃度下MDA的含量基本上小于旺蒼大葉枳。對(duì)照結(jié)果表明，隨著種子萌發(fā)時(shí)間的延伸，MDA含量也呈現(xiàn)逐漸增加的現(xiàn)象，說(shuō)明MDA參與種子萌發(fā)的代謝過(guò)程。

3.4 可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多是參與各種代謝的酶類(lèi)，在受到干旱脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生變化，測(cè)定其含量變化是了解植物抗逆性的一種重要方法［13］。由圖4可知，可溶性蛋白在一定時(shí)期內(nèi)并沒(méi)有隨著PEG濃度的增加而增加，兩個(gè)品種0～10d均在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，且兩個(gè)品種0～5d均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，脅迫至10d回升至初始狀態(tài)，檢測(cè)至15d時(shí)各個(gè)處理可溶性蛋白含量均有明顯增高趨勢(shì)。干旱脅迫抑制蛋白質(zhì)的合成并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解，從而使植株體內(nèi)的總蛋白質(zhì)含量降低［14］。本研究0～5d結(jié)果表明綠衣枳殼與旺蒼大葉枳的可溶性蛋白含量下降，與前人研究結(jié)果一致。在第5～15d上升的原因可能是在PEG脅迫下，激發(fā)了某種特殊的蛋白表達(dá)，此現(xiàn)象有待于今后進(jìn)一步研究。對(duì)照結(jié)果表明，隨著種子萌發(fā)時(shí)間的延伸，可溶性蛋白基本上沒(méi)有變化，推論可溶性蛋白較溫和參與種子萌發(fā)過(guò)程。

3.5 α－淀粉酶活性的動(dòng)態(tài)變化

α－淀粉酶是主要的淀粉水解酶，其活性的高低是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素，在種子萌發(fā)時(shí)，α－淀粉酶以水作為介質(zhì)，把種胚中的淀粉分解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，若α－淀粉酶不能發(fā)揮分解和轉(zhuǎn)化淀粉的作用，種子的萌發(fā)則受到抑制。由圖5可見(jiàn)，隨著PEG脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，兩個(gè)枳殼種子的α－淀粉酶的活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在0～5dα－淀粉酶含量增加迅速，5～10d呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，10～15d下降且下降趨勢(shì)較為明顯。綠衣枳殼的α－淀粉酶活性低于同一時(shí)間、同一脅迫濃度下的旺蒼大葉枳。對(duì)照α－淀粉酶活性變化保持相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明在PEG脅迫下α－淀粉酶發(fā)揮作用抑制種子萌發(fā)。

3.6 可溶性糖含量的動(dòng)態(tài)變化

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境中其含量會(huì)顯著增加以調(diào)節(jié)組織的滲透壓，從而提高植物的抗旱能力。圖6顯示隨著PEG脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，可溶性糖的含量呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組的可溶性糖基本上沒(méi)有變化。綠衣枳殼的可溶性糖含量隨時(shí)間延伸呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，隨PEG濃度的升高呈現(xiàn)升高再降低的趨勢(shì)，可見(jiàn)干旱脅迫也抑制可溶性糖的產(chǎn)生。旺蒼大葉枳的可溶性糖含量變化與綠衣枳殼相似，只是品種差異導(dǎo)致同一時(shí)期同一濃度旺蒼大葉枳的可溶性糖含量低于綠衣枳殼，與α－淀粉酶活性的變化趨勢(shì)正好相反，即綠衣枳殼的α－淀粉酶活性低于旺蒼大葉枳。

4 結(jié)論與討論

PEG模擬干旱脅迫將引起植物一系列的生理特性的變化。本研究表明PEG脅迫對(duì)兩種枳殼種子保護(hù)酶系統(tǒng)、MDA含量、滲透調(diào)節(jié)物和α－淀粉酶含量都有一定程度的影響。

在正常條件下，植物體內(nèi)的保護(hù)酶和自由基處于平衡狀態(tài)，但當(dāng)遭遇逆境時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的自由基和活性氧，對(duì)植物細(xì)胞造成傷害，但植物會(huì)動(dòng)員保護(hù)酶如POD、SOD來(lái)清除超出植物本身能夠承受的自由基，避免它對(duì)細(xì)胞膜的傷害，所以保護(hù)性酶在保持植物正常發(fā)育的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。前人研究結(jié)果顯示保護(hù)性酶與植物的抗氧化能力成正比，是評(píng)價(jià)植物抗逆性的重要標(biāo)志。本研究中，兩個(gè)枳殼的SOD、POD變化趨勢(shì)相似，均隨著脅迫濃度和時(shí)間的延伸，SOD、POD活性呈明顯上升的趨勢(shì)，干旱脅迫處理的酶活性高于對(duì)照，且輕度和中度脅迫與對(duì)照相比結(jié)果更為顯著。

丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化降解的產(chǎn)物之一，它與蛋白質(zhì)氨基酸殘基反應(yīng)生成的產(chǎn)物會(huì)降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致膜的滲漏，增大了細(xì)胞膜的選擇透性，使電解質(zhì)外滲，葉綠體膜、線粒體膜等亞細(xì)胞器膜的功能、結(jié)構(gòu)等破壞，導(dǎo)致生理功能的紊亂，MDA含量的增加會(huì)加重細(xì)胞膜的傷害。本研究表明，綠衣枳殼的MDA含量在同一時(shí)間、同一脅迫濃度下小于旺蒼大葉枳?？购盗?qiáng)的種的細(xì)胞膜透性和外滲量小于抗旱力弱的種，所以MDA含量高的樹(shù)種抗旱力弱，可初步推斷綠衣枳殼的抗旱力強(qiáng)。

植物在干旱脅迫條件下會(huì)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有效地提高植物滲透調(diào)節(jié)能力 以增強(qiáng)植物的抗旱性［15］。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括無(wú)機(jī)離子和有機(jī)物質(zhì)，其中有機(jī)物質(zhì)有可溶性蛋白、可溶性糖等?？扇苄蕴呛康脑黾佑欣谠鰪?qiáng)植物的抗旱性，本研究中，隨著PEG脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫強(qiáng)度的增加，可溶性糖含量逐漸上升，其中以中度脅迫最為敏感，綠衣枳殼的可溶性糖含量始終大于旺蒼大葉枳。本研究表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，枳殼種子中的α－淀粉酶活性先增加后減少，在脅迫開(kāi)始，α－淀粉酶活性增加以提高種子的抗旱力，表現(xiàn)了植物自身的應(yīng)激反應(yīng)，但隨著PEG脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，種子失水情況逐漸嚴(yán)重，而α－淀粉酶在行使其功能時(shí)又以水為介質(zhì)，隨著種子含水量的下降α－淀粉酶活性也下降。綠衣枳殼的α－淀粉酶活性始終高于旺蒼大葉枳，這表明綠衣枳殼的抗旱性更強(qiáng)，這與保護(hù)酶系統(tǒng)、MDA含量、滲透調(diào)節(jié)物的研究所得的結(jié)論相同。綠衣枳殼的可溶性糖含量高于旺蒼大葉枳，而α－淀粉酶活性低于旺蒼大葉枳，這個(gè)現(xiàn)象有待今后進(jìn)一步深入研究。

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