杜雄偉，儲(chǔ) 君，劉三俠，宋志元，劉 建，張要齊，張新蕾，孫雪峰

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連116600；2.河南惠通天下生物工程有限公司，新鄭451162；3.河南惠通天下動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州450008）

現(xiàn)代研究表明，在中藥研究中，應(yīng)用納米技術(shù)，可以使藥物活性和生物利用度提高，甚至產(chǎn)生新的特性，改變中藥劑型過于老化、單一的現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化[1]。本項(xiàng)目擬選聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)嵌段共聚物作為包載材料[2]，通過PLA-PEG納米載體體系包被處理的黃芪多糖不僅具有很好的控釋性、減少用藥次數(shù)，而且還具有提高生物利用度，減少用藥次數(shù)，而且還具有提高生物利用度，減少用藥量，增強(qiáng)對(duì)機(jī)體作用部位的靶向性，提高療效等優(yōu)點(diǎn)[3]。

l 材料

1.1 儀器與設(shè)備 精密電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器設(shè)備有限公司），紫外可見光分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），高速攪拌器（上海人邁儀器有限公司），磁力加熱攪拌器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司），高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），激光粒度分析儀（濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司），透射電鏡（日本電子公司），數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司。）

1.2 藥品與試劑 黃芪多糖、聚乳酸-聚乙二醇共聚物，二氯甲烷、聚乙烯醇、硫酸、苯酚、蒸餾水，以上均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒的制備 本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)乳法[4]來制備黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球。將多糖溶液加入到MPEG-PLA二氯甲烷溶液的油相中，在高速攪拌下得到乳白色初乳液，將初乳液加入到聚乙烯醇（PVC） 水溶液中，高速攪拌2-5分鐘，隨后將復(fù)乳液放在磁力攪拌器上以50-200rpm的速度攪拌直至有機(jī)溶劑揮發(fā)完，最后，將所剩乳白液高速離心15min，棄上清，取沉淀，沉淀經(jīng)三蒸水反復(fù)洗滌3次后，冷凍干燥后即得黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球。

2.2 檢測(cè)方法的建立（硫酸-苯酚法[5]）

2.2.1 試劑的配制 取苯酚100g，加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分，稱取此鎦分5g，加95m l蒸餾水，置棕色瓶中，得濃度為5%的苯酚試液。

2.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密稱取一定量納米粒供試品溶于2ml二氯甲烷中，完全溶解后，加入5m l蒸餾水，將其在漩渦混合器上充分混合，然后靜置1h，使水相與油相分離并收集水相。余下的油相按上述方法再處理一次，將兩次分離收集的水相溶液混合在一起，經(jīng)2000r/min離心5min后，取上清液2.0ml于具塞試管中，加5%的苯酚試液1m l，混勻，迅速加5m l濃硫酸，劇烈速冷卻，以苯酚-硫酸溶液作空白，在200-800nm范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1，確定測(cè)定波長(zhǎng)為491nm。

圖1 波長(zhǎng)掃描圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 穩(wěn)定性曲線圖

圖4（a） 黃芪多糖MPEG-PLA 嵌段共聚納米微球

圖4（b） 黃芪多糖MPEG-PLA 嵌段共聚納米微球

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取在105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100mg于干凈小燒杯中，加水溶解并定量至l00mL的容量瓶中，加水稀釋至容量刻度，混勻，即得Img／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液l.0mL.2.0mL、3.0mL.4.0mL、5.0mL.6.0mL置于l00mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。分別吸取以上各種濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL于具塞試管中，加5%的苯酚試液1mL，混勻，迅速加5mL濃硫酸，劇烈振搖2分鐘，然后置沸水浴加熱1 5分鐘，取出至冷水中迅速冷卻，備用。以苯酚.硫酸溶液作空白，于491nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。由圖2可知，黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球回歸方程為：y=15.03 7x--0.0035，r=0.9992(n=6)，納米粒在0.01-0.06mg/ML的濃度范罔內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取同一批次的黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微粒，按2.2.2中波長(zhǎng)選擇中樣品的處理方法操作，在波長(zhǎng)491nm處進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，樣品在1h內(nèi)顯色穩(wěn)定，可用于比色測(cè)定，結(jié)果見圖3。

2.3 微觀形態(tài)及粒徑檢測(cè) 取少量納米微球混懸液滴在潔凈的蓋玻片上，室溫下自然干燥，在掃描電鏡上進(jìn)行觀察，取少量納米微球混懸液，以蒸餾水稀釋100倍，用激光粒度儀測(cè)定納米微球粒徑及其粒度分散指數(shù)。黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球在掃描電鏡下觀察呈典型的球形，大小較均勻，表面光滑，分散性較好，無明顯粘連及融合。動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其平均粒徑為873nm，分散系數(shù)為0.753.結(jié)果見圖4（a）、4（b）。

2.4 載藥量（DL） 和包封率（ER） 的測(cè)定 精密稱取質(zhì)量為W的凍干微粒復(fù)溶之后，超速離心使納米粒沉淀在底部，沒有載上的藥物游離在上清液中，測(cè)定上清液中的藥物量，記為游離藥物W f；另取W 凍干微粒復(fù)溶后超聲破壞納米粒，離心，測(cè)定上清液中的藥物量，記為總的藥量WT。黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球包封率和載藥量計(jì)算公式：載藥量=WT/W×100% 包封率=（Wt-Wf） /WT×100%

2.5 正交工藝設(shè)計(jì) 采用兩步乳化法制備復(fù)乳，相關(guān)影響因素較多，主要包括制備PLA-PEG濃度，PVA濃度、多糖濃度、制備初乳時(shí)油相體積、內(nèi)水相體積，油水兩相體積比、攪拌速度、載藥量等?，F(xiàn)根據(jù)文獻(xiàn)及單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，固定MPEG-PLA二氯甲烷溶液作為油相的體積為20m l、多糖濃度為0.05g/m l、PVA外水相體積為100ml、采用四因素三水平的正交設(shè)計(jì)，重點(diǎn)考察MPEG-PLA濃度（mg/ml）、PVA濃度、內(nèi)水相體積、攪拌速度對(duì)黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微粒的粒徑、包封率和載藥量的影響，以確定最佳制備工藝。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平見表1，具體正交實(shí)驗(yàn)方案見表2.按照正交表制備納米粒，測(cè)定樣品的各個(gè)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)表

表3 不同工藝組微球載藥量

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果 按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備納米微球，測(cè)定樣品的各個(gè)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，具體結(jié)果見表2。

從上表極差分析結(jié)果可以看出，PVA濃度和內(nèi)水相體積對(duì)微球平均粒徑影響較大；攪拌速度和內(nèi)水相體積對(duì)微球的包封率影響較大。而對(duì)于納米微球米說，粒徑越小越好，包封率越大越好，故選擇PVA濃度為0.5%，攪拌速度為16000rpm。內(nèi)水相體積選擇D3有利于包封率增人，選擇D1有利于粒徑減小。

2.7 微球的載藥量 固定PVA濃度為0.5%(Al)，攪拌速度為16000rpm(B3)，選擇A1B3C2D1、A1B3C2D3、AIB3C3D1利AIB3C3D3四個(gè)工藝制備微球，經(jīng)硫酸-苯酚法測(cè)定各組微球的載藥量，見表3。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知內(nèi)水相體積對(duì)包封率和粒徑影響較大且剛好相反，從表3可知內(nèi)水相體積為D3的工藝組載藥量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于D1，故應(yīng)選擇內(nèi)水相體積為10mL(D3)。

從表3可以看出，MPEG-PLA濃度選擇C2或C3對(duì)載藥量影響不大，考慮到MPEG-PLA的昂貴成本，故選擇MPEG-PLA濃度為20mg/mL(C2)。綜上所述，微球制備的最佳工藝條件是：

黃芪多糖溶液體積為10mL、濃度為0.05g/mL，MPEG-PLA嵌段共聚物濃度為20mg/mL，PVA濃度為0.5%，攪拌速度為16000rpm，其中MPEG-PLA二氯甲烷作為油相固定體積為20mL，PVA外水相體積為l00mL。

2.8 體外釋放試驗(yàn) 參照優(yōu)化的工藝參數(shù)條件，按2，1方法制各黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球。

稱取微球樣品加入裝有50mL生理鹽水的燒杯中，分別于4h、ld、2d、3d、4d、6d、1Od等，不同時(shí)間取樣2mL于具塞試管中，加5%的苯酚試液ImL，混勻，迅速加5mL濃硫酸，劇烈振搖2分鐘，然后置沸水浴加熱15分鐘，取出至冷水中迅速冷卻，作為供試晶溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)各組不同時(shí)間釋放到介質(zhì)中多糖的吸光度，另取同一批次的微球樣品，用超聲波破碎后，同法測(cè)定吸光度。計(jì)算出不同時(shí)間段的累計(jì)釋放率。以時(shí)間d為橫坐標(biāo)，多糖累計(jì)釋放率為縱坐標(biāo)，作出載糖微球體外釋放曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 釋放曲線圖

3 討論

本試驗(yàn)采用復(fù)乳法制備微球，所得到的載藥微球電鏡掃描結(jié)果外形圓滑，顆粒大小均勻，平均粒徑873nm，包封率為78%，釋放率高達(dá)79.7%，釋放時(shí)間較長(zhǎng)為10天，且釋放平緩，突釋率較低。說明采用MPEG-PLA二氯甲烷溶液作為油相、黃芪多糖水溶液作為內(nèi)水相，PVA水溶液作為外水相制備黃芪多糖MPEG-PLA嵌段共聚納米微球的工藝穩(wěn)定可行，可用丁實(shí)際生產(chǎn)中參考。

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[2]魏芬芬.星型PLA-PEG嵌段共聚物的合成及其在藥物負(fù)載中的應(yīng)用[D].華南理工大學(xué)，材料學(xué)，2010，

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