張 靜，沈永青，智利彩，常 亮，仇 煒

1.石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北 石家莊 050011；2.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050020；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191；4.石家莊市鹿泉區(qū)人民醫(yī)院外科，河北 石家莊 050020；5.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京 100050

紫檀芪誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

張 靜1，沈永青2，智利彩1，常 亮3，仇 煒4，5

1.石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北 石家莊 050011；2.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050020；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191；4.石家莊市鹿泉區(qū)人民醫(yī)院外科，河北 石家莊 050020；5.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京 100050

背景與目的：紫檀芪是一種天然抗氧化劑，其抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的效果仍不明確。擬探討紫檀芪對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬的作用，并初步闡明其作用機(jī)制。方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法測(cè)定細(xì)胞的增殖活力，Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，吖啶橙染色觀察細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的變化，蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)LC3B及P62蛋白的表達(dá)。結(jié)果：紫檀芪顯著抑制WERI-Rb-1細(xì)胞的增殖活力（P＜0.01），以25、50和100 μmol/L的藥物濃度作用細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞增殖活力分別為（93.02±0.47）%、（55.10±2.04）%和（30.33±1.45）%；50 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞12、24和48 h時(shí)，細(xì)胞增殖活力分別為（88.38±3.70）%、（53.37±1.17）%和（29.60±1.05）%。紫檀芪顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P＜0.01），對(duì)照組、24和48 h細(xì)胞的凋亡率分別為（4.08±0.79）%、（13.44±2.12）%和（23.49±2.01）%。紫檀芪能夠激活WERI-Rb-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，上調(diào)LC3蛋白的表達(dá)，下調(diào)P62蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的數(shù)量（P＜0.01）。3-MA及Beclin1 siRNA抑制細(xì)胞自噬后能夠部分逆轉(zhuǎn)紫檀芪的抗腫瘤作用（P＜0.01）。3-MA抑制細(xì)胞自噬后，紫檀芪處理組的細(xì)胞凋亡率為（12.97±2.09）%，3-MA+紫檀芪組為（8.35±1.11）%。siRNA敲低Beclin1后，紫檀芪處理組和siRNA+紫檀芪組的細(xì)胞凋亡率分別為（13.80±2.19）%和（9.62±0.52）%。結(jié)論：紫檀芪可以顯著抑制WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖并激活細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

紫檀芪；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；自噬

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是發(fā)病率最高的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率約為1∶18 000至1∶21 000［1］。治療以手術(shù)和化療為主，雖然目前的療效已經(jīng)有明顯改善，患兒的生存率已有很大提高，但是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作為一種惡性疾病，仍舊危害著廣大患兒的健康。紫檀芪是一種從植物中提取的天然化合物，其主要存在于藍(lán)莓和葡萄中，毒性低，安全性高［2-3］。該化合物屬多羥基二苯乙烯類(lèi)化合物，其本身是一種天然抗氧化劑，具有顯著的抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用［4］。在腫瘤研究方面，目前已知紫檀芪能夠抗口腔癌、乳腺癌、肝癌和惡性黑素瘤等多種惡性腫瘤［5-8］，具有顯著的抗腫瘤活性。紫檀芪的生物學(xué)活性多樣，在某些方面甚至強(qiáng)于其同系物白藜蘆醇［9-10］，所以對(duì)紫檀芪進(jìn)行深入的基礎(chǔ)研究，有助于未來(lái)紫檀芪的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本研究以人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討紫檀芪對(duì)其的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用，并初步闡明作用機(jī)制，從而為該化合物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，紫檀芪（規(guī)格：10 mg，純度≥97%）、吖啶橙（acridine orange，AO）及LC3B抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，P62及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，3-MA及人Beclin1 siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)基使用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為1%的青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)使用無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM2000使用說(shuō)明制備脂質(zhì)體-siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，滴加入細(xì)胞后6 h換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WERI-Rb-1細(xì)胞，傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔約10 000個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜后給予相應(yīng)藥物處理，給藥時(shí)間足夠后，更換培養(yǎng)基（100 μL/孔），每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)溫育2 h，酶標(biāo)儀比色，比色波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.3 Annexin V/PI凋亡試驗(yàn)

細(xì)胞常規(guī)消化，100×g離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞2次后，緩慢加入500 μL結(jié)合緩沖液，輕柔振蕩重懸細(xì)胞，加入Annexin V和PI各5 μL于細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻后室溫避光染色15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)

收集細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液冰上操作裂解細(xì)胞，BCA法蛋白定量，與上樣緩沖液混勻后加熱變性，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉后，一抗過(guò)夜，次日洗膜后，二抗37 ℃溫育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光。本研究所用一抗?jié)舛染鶠?∶1 000。

1.2.5 AO染色試驗(yàn)

將AO（1 μg/mL）緩慢滴加入待測(cè)細(xì)胞，避光室溫染色5 min，吸出AO，PBS緩沖液小心洗滌兩遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照存檔。隨機(jī)計(jì)數(shù)，每組最少計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 紫檀芪對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響

為了檢測(cè)紫檀芪是否有抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用，本研究使用了CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，DMSO組細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.337），紫檀芪給藥組細(xì)胞隨著給藥濃度的不同，細(xì)胞增殖活力均出現(xiàn)了不同程度的下降，藥物濃度在25、50及100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活力分別為（93.02±0.47）%、（55.10±2.04）%和（30.33±1.45）%，細(xì)胞增殖活力下降具有量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1A）。使用50 μmol/L紫檀芪處理WERI-Rb-1細(xì)胞，分別在12、24和48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活力進(jìn)行檢測(cè)，紫檀芪的增殖活力分別為（88.38±3.70）%、（53.37±1.17）%和（29.60±1.05）%，較對(duì)照組明顯下降，其變化具有時(shí)效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）。進(jìn)一步使用Annexin V/PI流式細(xì)胞儀對(duì)紫檀芪的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，紫檀芪對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，藥物作用24和48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別由對(duì)照組的（4.08±0.79）%上升至（13.44±2.12）%和（23.49±2.01）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1C）。上述結(jié)果表明，紫檀芪具有顯著的抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERIRb-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

2.2 紫檀芪對(duì)于WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞自噬的影響

圖 1 紫檀芪對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響Fig. 1 Pterostilbene inhibits proliferation of WERI-Rb-1 cells and induces cell apoptosis

LC3是檢測(cè)細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白之一，LC3前體在合成、加工修飾之后成為L(zhǎng)C3-Ⅰ型蛋白，當(dāng)細(xì)胞自噬激活時(shí)，LC3-Ⅰ型蛋白酯化成LC3-Ⅱ型蛋白并定位于自噬囊泡上。使用Western blot對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，在給予了紫檀芪（50 μmol/L）作用12及24 h之后，細(xì)胞的LC3-Ⅱ型蛋白的含量明顯上升（圖2A）。P62蛋白是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白之一，其本身是細(xì)胞自噬的特異性底物，通過(guò)細(xì)胞自噬進(jìn)行降解。P62蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，紫檀芪（50 μmol/L）作用WERI-Rb-1細(xì)胞12和24 h后，細(xì)胞的P62蛋白的含量明顯下降（圖2A）。我們又進(jìn)一步使用AO對(duì)細(xì)胞染色觀察，結(jié)果表明，在紫檀芪（50 μmol/L，12 h）處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的數(shù)量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2B、C）。上述結(jié)果說(shuō)明，紫檀芪能夠明顯激活WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞自噬活動(dòng)。

圖 2 紫檀芪誘導(dǎo)WERI-Rb-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬Fig. 2 Pterostilbene induces autophagy in WERI-Rb-1 cells

2.3 紫檀芪誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系

3-MA是細(xì)胞自噬的抑制劑。本研究使用該抑制劑抑制了WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞自噬活動(dòng)后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，紫檀芪處理組的細(xì)胞凋亡率為（12.97±2.09）%，而3-MA+紫檀芪組的細(xì)胞凋亡率為（8.35±1.11）%，3-MA能夠顯著逆轉(zhuǎn)紫檀芪對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用（P＜0.01，圖3A）。Beclin1是細(xì)胞自噬發(fā)生的關(guān)鍵蛋白之一，我們又進(jìn)一步使用了siRNA敲低Beclin1后進(jìn)行檢測(cè)，紫檀芪處理組和siRNA+紫檀芪組的凋亡率分別為（13.80±2.19）%和（9.62±0.52）%，干擾自噬能夠顯著影響紫檀芪的抗腫瘤作用（P＜0.01，圖3B）。上述結(jié)果說(shuō)明，紫檀芪的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)部分依賴(lài)于激活細(xì)胞自噬發(fā)揮作用。

圖 3 紫檀芪（50 mmol/L， 24 h）通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig. 3 Pterostilbene （50 mmol/L， 24 h） induces cell apoptosis via autophagy induction

3 討 論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的兒童惡性腫瘤之一，未經(jīng)治療的兒童通常會(huì)在1～2年內(nèi)死亡［11］。目前視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療原則是在保障患者生存的前提下盡最大可能保留患眼及患者殘存的視功能。治療手段主要為手術(shù)、化療和放療。隨著治療技術(shù)的提高，近年來(lái)完全通過(guò)眼球摘除手術(shù)治療的方法已經(jīng)較少采用?；熀头暖熓亲畛Ｓ玫谋Ｊ刂委煼椒?，但是化療存在導(dǎo)致腫瘤耐藥、化療不敏感的問(wèn)題，放療在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的應(yīng)用中也存在著導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的可能性，所以找到更好的保守治療方法是臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。

紫檀芪是安全性很高的天然化合物，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物白藜蘆醇在腫瘤方面的研究已經(jīng)很多，而關(guān)于紫檀芪的研究相對(duì)較少。目前已知紫檀芪的抗腫瘤作用多樣，是一種多靶點(diǎn)的抗腫瘤化合物。Pan等［6］的研究顯示，紫檀芪能夠靶向抑制雌激素受體α36從而誘導(dǎo)雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞死亡。Suganya等［7］的研究顯示，紫檀芪能夠使肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。Schneider等［8］在惡性黑素瘤中也發(fā)現(xiàn)紫檀芪能夠抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖，激活Caspase系統(tǒng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究檢測(cè)了紫檀芪對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用，并發(fā)現(xiàn)了相同的作用效果，紫檀芪處理WERI-Rb-1細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯上升。細(xì)胞自噬是細(xì)胞正常的生理活動(dòng)之一，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和能量代謝方面具有重要作用。細(xì)胞自噬在腫瘤中的具體作用目前還不是十分清楚。已有研究顯示，白藜蘆醇能夠激活乳腺癌細(xì)胞自噬［12］，推測(cè)紫檀芪可能也具有類(lèi)似的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在給予了紫檀芪后，WERIRb-1細(xì)胞的LC3-Ⅱ型蛋白明顯上升，P62蛋白顯著下降，進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)紫檀芪處理后的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬囊泡數(shù)量較對(duì)照組明顯增加。上述結(jié)果證實(shí)紫檀芪能夠激活WERI-Rb-1細(xì)胞的細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系目前還不是很清楚，有研究表明細(xì)胞自噬顯著激活或抑制時(shí)均能夠觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)紫檀芪的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)與細(xì)胞自噬相關(guān)，在抑制了細(xì)胞自噬后，細(xì)胞凋亡率也明顯下降，紫檀芪的抗腫瘤作用被部分逆轉(zhuǎn)。

本研究從體外水平對(duì)紫檀芪的抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的效果進(jìn)行了驗(yàn)證，并初步闡明其抗腫瘤作用與細(xì)胞自噬激活有關(guān)，拓寬了紫檀芪的抗腫瘤譜，豐富了紫檀芪的抗腫瘤作用機(jī)制，為其未來(lái)的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Pterostilbene induces retinoblastoma WERI-Rb-1 cell apoptosis via autophagy induction

ZHANG Jing1， SHEN Yongqing2， ZHI Licai1， CHANG Liang3， QIU Wei4，5（1.Prenatal Diagnosis Center， Fourth Hospital of Shijiazhuang， Shijiazhuang 050011， Hebei， China； 2.College of Nursing， Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200， Hebei， China； 3.Department of Gynaecology and Obstetrics，Peking University Third Hospital， Beijing 100191， China； 4.Department of Surgery， the People’s Hospital of Luquan District， Shijiazhuang 050200， Hebei， China； 5.Department of Urology， Beijing Friendship Hospital， Beijing 100050， China）

QIU Wei E-mail: qiuwei618@163.com

Background and purpose: Pterostilbene is a natural antioxidant， whose role in retinoblastoma remains unclear. The aim of this study is to probe the effects of pterostilbene on the proliferation， apoptosis and autophagy in retinoblastoma WERI-Rb-1 cell lines. Methods: Cell counting kit-8 （CCK-8） assays were used toanalyze the effects of pterostilbene on the proliferation of WERI-Rb-1 cells. Apoptosis rate was determined by Annexin V/PI. Autophagic vacuoles were observed by acridine orange staining. LC3 and P62 protein expressions were determined using Western blot. Results: Pterostilbene significantly inhibited the proliferation of WERI-Rb-1 cells （P＜0.01）. The cell viability were （93.02±0.47）%， （55.10±2.04）% and （30.33±1.45）% after WERI-Rb-1 cells were treated with 25， 50 and 100 μmol/L pterostilbene for 24 h， and the cell viability were （88.38±3.70）%， （53.37±1.17）%，（29.60±1.05）% after WERI-Rb-1 cells were treated with 50 μmol/L pterostilbene for 12， 24 and 48 h. Pterostilbene induced cell apoptosis （P＜0.01）， the apoptosis rates of control group， 24 h treated group and 48 h treated group were（4.08±0.79）%， （13.44±2.12）% and （23.49±2.01）%. Pterostilbene induced autophagy of WERI-Rb-1 cells， increased LC3 expression， downregulated P62 expression and increased the number of autophagic vacuoles in WERI-Rb-1 cells（P＜0.01）. 3-MA and Beclin1 were able to rescue pterostilbene-induced cell death （P＜0.01）. After 3-MA was used to blunt autophagosome formation， the apoptosis rate markedly decreased in 3-MA+pterostilbene-treated cells compared with cells treated with pterostilbene alone ［（12.97±2.09）% vs （8.35±1.11）%］， and after siRNA was used to knockdown Beclin1， the apoptosis rate had the same change ［（13.80±2.19）% vs （9.62±0.52）%］. Conclusion: Pterostilbene can inhibit the proliferation of WERI-Rb-1 cells and induce cell apoptosis via autophagy activation.

Pterostilbene； Retinoblastoma； Cell apoptosis； Cell proliferation； Cell autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.11.010

R739.7+2

A

1007-3639（2015）11-0900-06

2015-05-15

2015-07-27）

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（ZD20140032）。

仇煒 E-mail：qiuwei618@163.com