馬 勇，鞠志花，王秀革，張 燕，王長(zhǎng)法，劉樹(shù)真

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心,山東濟(jì)南 250131)

?

學(xué)科動(dòng)態(tài)

粘著斑激酶FAK基因功能研究進(jìn)展*

馬 勇1,2，鞠志花2，王秀革2，張 燕2，王長(zhǎng)法2*，劉樹(shù)真*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心,山東濟(jì)南 250131)

粘著斑激酶FAK是一類(lèi)胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，有細(xì)胞粘附、凋亡、分化、遷移/移動(dòng)、細(xì)胞周期進(jìn)程及連接重建等功能。論文概述了FAK的結(jié)構(gòu)、蛋白定位和FAK的幾種可變剪切體的形式，重點(diǎn)闡述了FAK與腫瘤的關(guān)系，F(xiàn)AK在生殖和早期發(fā)育方面的作用，對(duì)FAK在腫瘤研究以及生殖方面研究提出了有意義的方向。

FAK；腫瘤促進(jìn)；生殖

粘著斑激酶( focal adhesion kinase,FAK)是一類(lèi)胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase PTKs)，屬于蛋白酪氨酸激酶超家族，F(xiàn)AK在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，它是胞內(nèi)外信號(hào)出入的中樞，介導(dǎo)多條信號(hào)通路。FAK可以接受來(lái)自整合素、生長(zhǎng)因子以及機(jī)械刺激等的信號(hào)，激活胞內(nèi)PI3K/Akt、Ras/MAPK 等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。FAK還與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生與遷移有關(guān)。Ryu關(guān)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的研究表明：miR-708能靶向結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白neuronatin(NNAT)，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，導(dǎo)致ERK和FAK活性的降低，從而降低細(xì)胞遷移，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移[1]。FAK作為細(xì)胞粘附和細(xì)胞移動(dòng)起作用的信號(hào)分子在血睪屏障中也起到重要作用。精卵受精需要完成一系列事件，涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與這些途徑的一系列酪氨酸蛋白激酶的表達(dá)明顯高于其它細(xì)胞。本文對(duì)FAK的結(jié)構(gòu)和蛋白定位以及FAK在腫瘤、生殖和早期發(fā)育方面的作用進(jìn)行概述。

1 FAK基因家族的結(jié)構(gòu)及其蛋白的定位研究

1.1FAK的表達(dá)和蛋白定位

目前，F(xiàn)AK家族共有兩個(gè)成員，PTK2(FAK)和Pyk2(proline-rich tyrosine kinasen 2, Pyk2)。Pyk2蛋白與FAK蛋白有48%的相同氨基酸，這兩種激酶都不含SH2和SH3結(jié)構(gòu)，屬于非受體酪氨酸激酶。FAK幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞和組織類(lèi)型，在睪丸和腦中高表達(dá)。FAK最先在v-Src[2]和BALB/c3T3[3]成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)的雞胚胎細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，它是一種非受體125 kDa酪氨酸激酶，因其定位在粘著斑上所以命名為粘著斑激酶，它還具有酪氨酸激酶活性，能在受到原癌基因產(chǎn)物和胞外基質(zhì)-整合素的刺激后發(fā)生磷酸化。組織特異性表達(dá)的該基因RNA經(jīng)可變剪切可產(chǎn)生不同自身磷酸化率的FAK的亞型，在脊椎動(dòng)物中高度保守[4-6]。為了便于區(qū)分，將沒(méi)有增添額外外顯子的FAK定為標(biāo)準(zhǔn)亞型，命名為FAK0，在903殘基之后插入的三個(gè)殘基的FAK亞型稱(chēng)為FAK+[7-8]，在392殘基之后插入六個(gè)額外的殘基(box6)稱(chēng)為FAK6，在411位置之后插入7個(gè)殘基(box7)的稱(chēng)為FAK7，F(xiàn)AK6+7是指上述三種殘基插入均有，F(xiàn)AK+6,7,28是指在靠近N末端增添額外的28個(gè)殘基。FAK6+7插入的兩個(gè)短肽(box6和box7)在Tyr-397的兩邊，是在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的主要亞型，在嚙齒動(dòng)物的海馬中，該亞型能夠被幾種神經(jīng)遞質(zhì)或者神經(jīng)調(diào)質(zhì)刺激從而自磷酸化，顯示該亞型在神經(jīng)元的發(fā)育和突觸的可塑性方面可能起重要作用。所有的亞型在細(xì)胞和體外都能自磷酸化，當(dāng)Tyr-397被磷酸化后可募集Src家族激酶磷酸化FAK的其它殘基如Tyr-576和Tyr-577,從而增加FAK活性，Tyr-925的激活又為含有SH2結(jié)構(gòu)域的Grb2蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)，從而通過(guò)Ras途徑介導(dǎo)ERK1/2的激活?？勺兗羟羞€改變了FAK的自磷酸化率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫沉淀激酶測(cè)試(CITIK assays)結(jié)果顯示FAK+與FAK0有相同的自磷酸化能力，F(xiàn)AK+6,7與FAK+6,7,28的自磷酸化能力增加，Boxes 6和7都有助于自磷酸化能力的增強(qiáng)[9]，單獨(dú)box7比單獨(dú)的box6具有更強(qiáng)的自磷酸化能力。研究表明FAK的N末端的刪除能夠增加酪氨酸的磷酸化活性和FAK的自磷酸化活性[10-11]，說(shuō)明FAK的N末端FERM/JEF區(qū)域?qū)τ贔AK的分子間自磷酸化有抑制作用。文獻(xiàn)來(lái)源研究結(jié)果還表明FAK+的自磷酸化是由于分子間的反應(yīng)，且FAK+的二聚化足以引起Tyr-397的磷酸化。而FAK+6,7除了有分子間的磷酸化能力還存在分子內(nèi)的自磷酸化能力，并且對(duì)于N末端的抑制沒(méi)有那么敏感。在轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中，C末端區(qū)域的刪除能夠阻止FAK+的Tyr-397的磷酸化，但對(duì)于FAK+6,7,28沒(méi)有影響。表明環(huán)繞在Tyr-397位點(diǎn)額外的殘基序列的增加改變了FAK的自磷酸化機(jī)制。

1.2FAK的結(jié)構(gòu)

FAK是一種非受體125 kDa酪氨酸激酶，由1028個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)上可分為4個(gè)功能域:在N端附近的FERM區(qū)域、中央催化激酶域、三個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域PRI, PRII, PRIII和在C末端附近的粘著斑目標(biāo)域(focal adhension targeting sequence FAT)(圖1)。FAK的羧基端存在多個(gè)可與細(xì)胞骨架蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，其功能可能是將多種蛋白聚集在一起。在FAK羧基末端的150個(gè)氨基酸中包含一個(gè)粘著斑定位序列，對(duì)于FAK與粘著斑相連是充分而且又必要的序列。已知FAK有6個(gè)可以磷酸化的位點(diǎn)：Tyr-397, -407, -576, -577,-861和 -925，其中Tyr397是主要的自身磷酸化位點(diǎn)，F(xiàn)AK的N末端附近和整合素受體如β1整合蛋白相互作用介導(dǎo)構(gòu)象變化暴露Tyr-397位點(diǎn)，創(chuàng)造出與不同的調(diào)節(jié)蛋白如Src家族激酶、PI-3K,PLC-γ，Grb7，PTEN，和Nck-2結(jié)合的位點(diǎn)(圖1)。因此這些蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域可以與FAK結(jié)合。然而，盡管整合蛋白沒(méi)有內(nèi)在催化活性，它和FAK的相互作用和接下來(lái)它的配體和整合蛋白的耦合能介導(dǎo)下游信號(hào)影響細(xì)胞功能。事實(shí)上，在體外支持細(xì)胞-精子細(xì)胞共培養(yǎng)中[12]，p-FAK-Tyr397在結(jié)構(gòu)上可以和β1整合蛋白、粘著斑蛋白、c-Src通過(guò)建立起來(lái)的錨定連接(橋粒連接、ES)相互作用。其它的五個(gè)磷酸化位點(diǎn)是Src家族激酶的靶位結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)這五個(gè)磷酸化位點(diǎn)的任何一個(gè)激活FAK介導(dǎo)內(nèi)在激酶活性，或者募集調(diào)節(jié)蛋白、信號(hào)蛋白到FAK來(lái)影響細(xì)胞功能。例如，F(xiàn)AK激酶域內(nèi)的Tyr-576 和 Tyr-577的磷酸化提高它的內(nèi)在激酶催化活性，被磷酸化的Tyr925可以與接頭蛋白Grb2 結(jié)合, 作為一個(gè)配體募集Sos與FAK相互聯(lián)系，激活下游ERK1/2、JNK、MAPK信號(hào)事件，有助于FAK介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞生存。最后，F(xiàn)AK的FAT能夠與樁蛋白、踝蛋白及信號(hào)蛋白Stat-1相互聯(lián)系。FAT也能夠通過(guò)樁蛋白將FAK連接到整合蛋白(圖1)。

圖1 FAK結(jié)構(gòu)及不同功能領(lǐng)域模式示意圖[13]

2 FAK的功能

FAK作為一種高酪氨酸磷酸化的蛋白定位在整合素豐富的細(xì)胞粘附位點(diǎn)，是整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)者，可調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)、粘附、凋亡、分化、遷移/移動(dòng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、連接重建及不同上皮細(xì)胞的緊密連接滲透性，大量研究顯示FAK在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量上升，說(shuō)明FAK在腫瘤細(xì)胞中起到一定作用。然而，F(xiàn)AK在睪丸中的表達(dá)量比非性腺組織要高20～100倍[14]，提示FAK在生理生殖和早期胚胎發(fā)育可能有重要作用。

2.1FAK與腫瘤

FAK在細(xì)胞增殖和生存過(guò)程中起作用大都是通過(guò)體外培養(yǎng)的細(xì)胞系研究證明的。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的FAK的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞周期中G1到S期的加速轉(zhuǎn)變，增加了細(xì)胞周期素D的表達(dá)，表明了FAK在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面的作用[15]。Zhao等[16]報(bào)道FAK在纖維母細(xì)胞的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了ERK的激活，加速了細(xì)胞周期進(jìn)程，Western blot顯示星形細(xì)胞瘤中細(xì)胞周期蛋白D和E表達(dá)上升，為了探究腫瘤組織中FAK的下游信號(hào)或許對(duì)FAK的活性增強(qiáng)有影響，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中主要表達(dá)Shc的52-kDa亞型，而在正常組織中主要表達(dá)Shc的46-kDa亞型，這兩種亞型在序列、區(qū)域及功能方面的同源性都很高，在正常組織與在腫瘤組織中表達(dá)不同的亞型意義不明確。此外，腫瘤組織中的FAK和磷酸化的Shc可發(fā)生免疫共沉淀現(xiàn)象，但非腫瘤腦組織中FAK卻不能和磷酸化的Shc發(fā)生免疫共沉淀現(xiàn)象，這和體外研究的惡性星形細(xì)胞瘤的FAK的表達(dá)和Shc與FAK的聯(lián)系增強(qiáng)的結(jié)果是一致的。Burgaya等通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在正常成年大鼠腦組織的FAK蛋白因?yàn)樵谧粤姿峄稽c(diǎn)有3個(gè)外顯子的插入[17]，電泳位置在129 kDa處。這些研究者用含有FAK可變剪切的片段轉(zhuǎn)染在體外培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸397的磷酸化水平提高。用體外FAK轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，自磷酸化位點(diǎn)的可變剪切體的表達(dá)能夠抑制Src對(duì)FAK酪氨酸397位點(diǎn)的磷酸化[18]。而Timothy的研究表明在缺乏可變剪切的腫瘤樣品與存在可變剪切的非腫瘤組織相比卻表現(xiàn)出高4倍的FAK磷酸化水平，因而FAK是否存在可變剪切體或許可作為惡性星形細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)志。Agochiya等[19]發(fā)現(xiàn)人的幾種腫瘤細(xì)胞系的FAK水平的升高和這幾種細(xì)胞的FAK基因的擴(kuò)增相關(guān)，F(xiàn)AK基因位于人的8號(hào)染色體上，擴(kuò)增時(shí)與FAK臨近的c-myc基因也擴(kuò)增，F(xiàn)AK基因的擴(kuò)增可能促進(jìn)了FAK蛋白的表達(dá)。Western blot分析表明FAK蛋白在一級(jí)腫瘤中磷酸化水平很低，ERK-2的活性也很低，從而FAK活性很低，所以腫瘤細(xì)胞的增殖遷移能力都很低，這也就是為什么早期腫瘤易于治療而晚期腫瘤因?yàn)镕AK表達(dá)量高使得腫瘤細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移而難以治療的一個(gè)原因所在。上述研究表明FAK蛋白在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平升高，伴隨著酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體的激活和升高，導(dǎo)致FAK、Src活性的升高以及Shc磷酸化的增加，ERK的激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

2.2FAK在生殖和早期胚胎發(fā)育方面的作用

2.2.1FAK與血睪屏障(blood-testis barrier，BTB) 在雄性哺乳動(dòng)物的睪丸中，存在一種重要的屏障結(jié)構(gòu)-血睪屏障。血睪屏障在生理上將生精上皮分為兩個(gè)腔室：基底小室和近腔小室?；仔∈覂?nèi)主要有精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞，而近腔小室有精子發(fā)生過(guò)程中各個(gè)階段的生精細(xì)胞。前細(xì)線期精母細(xì)胞必須穿過(guò)血睪屏障才能進(jìn)入近腔小室，該過(guò)程涉及多種分子及相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。免疫組化和免疫熒光研究結(jié)果顯示FAK存在于生精上皮周期血睪屏障的所有階段，但在生精上皮周期的階段八初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)BTB處時(shí)，BTB處的FAK大大減少，表明FAK可能是BTB完整性的調(diào)節(jié)成分。免疫共沉淀顯示FAK是在BTB處的occludin/zonula occludens-1蛋白復(fù)合物的組成成分，免疫共染睪丸切片顯示FAK與occludin/ZO-1共定位[20]。當(dāng)用鎘處理血睪屏障而導(dǎo)致BTB最終破壞時(shí)，檢測(cè)到FAK與閉合蛋白(occludin)和ZO-1的聯(lián)系的瞬間增加[21]，表明FAK對(duì)occludin和ZO-1的磷酸化的增加導(dǎo)致BTB的紊亂。為研究FAK的重要性，在體外培養(yǎng)FAK敲除的支持細(xì)胞，支持細(xì)胞建立緊密連接屏障結(jié)構(gòu)和basal ectoplasmic specialization(basal ES)超微結(jié)構(gòu)，當(dāng)跨膜電阻經(jīng)過(guò)支持細(xì)胞的時(shí)候，敲除FAK的支持細(xì)胞建立起來(lái)的緊密連接屏障丟失，這種屏障功能的丟失伴隨著occludin和Junctional adhesion molecule A(JAM-A)在支持細(xì)胞分布的變化，可能因?yàn)榈鞍踪|(zhì)內(nèi)吞作用的提升，使得這些蛋白質(zhì)從細(xì)胞-細(xì)胞接觸面移到細(xì)胞質(zhì)。FAK的敲除導(dǎo)致occludin的Tyr(P<0.05)和Ser(P<0.01)的磷酸化降低，但Thr的磷酸化沒(méi)有降低，這和先前的研究報(bào)道，F(xiàn)AK調(diào)節(jié)閉合蛋白的磷酸化，使得磷酸化的閉合蛋白能夠募集到BTB組裝成緊密連接纖維，從而保持BTB的完整性[22-23]結(jié)論一致。FAK及時(shí)調(diào)節(jié)BTB“開(kāi)”、“關(guān)”，從而促進(jìn)精子發(fā)生過(guò)程中生精上皮周期處于階段八的前細(xì)線期精母細(xì)胞通過(guò)血睪屏障進(jìn)入近腔室中。在生精上皮周期期間BTB必須保持“關(guān)閉”狀態(tài)(圖2右頂端)，然而，當(dāng)外部刺激、雄激素/雄激素受體水平的降低、睪丸暴露于環(huán)境毒物(如鎘)等這些情況都能介導(dǎo)FAK從occludin/ZO-1蛋白復(fù)合體分離或者功能喪失。這會(huì)導(dǎo)致FAK對(duì)閉合蛋白o(hù)ccludin的磷酸化水平降低，引起內(nèi)吞作用和內(nèi)吞作用介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的加速，導(dǎo)致BTB不穩(wěn)定允許BTB“打開(kāi)”，從而使得在生精上皮周期中發(fā)育到階段八的前細(xì)線期精母細(xì)胞進(jìn)入近腔室(圖2)。

圖2 FAK-閉合蛋白-ZO-1蛋白復(fù)合物(左)調(diào)節(jié)睪丸BTB的重建示意圖[24]

在上皮細(xì)胞周期中，階段I-VII(右圖頂端)，F(xiàn)AK使得位于BTB的緊密連接纖維處的閉合蛋白保持最優(yōu)的磷酸化狀態(tài)。然而，外界刺激如在階段VIII-IX由精子或者支持細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子或者外界毒物(如鎘)，介導(dǎo)閉合蛋白的脫磷酸化，引起復(fù)合物從ZO-1的分離和重新分布，或許是通過(guò)內(nèi)吞作用介導(dǎo)的，使得BTB不穩(wěn)定(右圖底部)。

晚期精母細(xì)胞進(jìn)入近腔室，經(jīng)歷減數(shù)第一次分裂和第二次分裂之后形成圓形精子。圓形精子經(jīng)歷形態(tài)變化和1-19(在大鼠中經(jīng)歷19個(gè)步驟，在小鼠中經(jīng)歷16個(gè)步驟，在人中經(jīng)歷6個(gè)步驟)個(gè)步驟分化后成為完全成熟的精子[25]。而在步驟8-19的精子和支持細(xì)胞之間出現(xiàn)一種新的特有的錨定連接形式稱(chēng)為apical ectoplasmic specialization (apical ES)[26-28]。有研究報(bào)道在apical ES存在一種FAK-p130Cas -DOCK180-RhoA-vinculin信號(hào)蛋白復(fù)合物，也是一種以β1整合蛋白為基礎(chǔ)的粘附復(fù)合物。免疫組化顯示除了p-FAK-Tyr397 和 p-FAK-Tyr576，β1整合蛋白、p130Cas、RhoA 和 vinculin在生精上皮周期中都是階段特異性表達(dá)。β1整合蛋白結(jié)合到p-FAK，創(chuàng)建了一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的蛋白質(zhì)復(fù)合物β1整合蛋白-p-FAK-p130Cas-DOCK180-RhoA-vinculin。這一復(fù)合物的產(chǎn)生，或許是通過(guò)激活FAK的Tyr397和Tyr576位點(diǎn)而募集p130Cas、Dock180和粘著斑蛋白，同時(shí)這一過(guò)程也涉及Crk、R-ras和Grb2激活RhoA，共同調(diào)節(jié)apical ES以肌動(dòng)蛋白絲束為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)和其它肌動(dòng)蛋白質(zhì)，共同調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲束的“可塑性”和“流動(dòng)性”，來(lái)調(diào)節(jié)apical ES的“粘附”和“脫粘附”，協(xié)調(diào)精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)育中的精子能及時(shí)通過(guò)生精上皮。從而促進(jìn)精子發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞事件進(jìn)行。P-糖蛋白( P-glycoprotein)隸屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，是研究最為透徹的一員，主要功能是防止機(jī)體對(duì)外來(lái)有害物質(zhì)的攝入。P-糖蛋白和FAK都定位在BTB支持細(xì)胞中[29]，F(xiàn)AK是閉合蛋白/ZO-1復(fù)合物的組成成分，該復(fù)合物能夠通過(guò)磷酸化BTB處的閉合蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。體外培養(yǎng)支持細(xì)胞3天后建立功能性緊密連接屏障，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白可和FAK結(jié)構(gòu)上相互作用，然后用RNA干擾技術(shù)敲除P-糖蛋白，發(fā)現(xiàn)閉合蛋白幾乎和ZO-1失去聯(lián)系，但是和FAK的相互作用增加。FAK能夠使閉合蛋白的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化分別降低和增加，但酪氨酸磷酸化不變，在P-糖蛋白敲除后FAK和閉合蛋白的相互作用增加，改變了閉合蛋白正常的磷酸化狀態(tài)，使得BTB處支持細(xì)胞之間的粘附連接降低，從而引起支持細(xì)胞緊密連接屏障的瞬間干擾。而P-糖蛋白敲除后，閉合蛋白/ZO-1復(fù)合物失去平衡，從而導(dǎo)致閉合蛋白和ZO-1蛋白-蛋白相互作用的丟失，也導(dǎo)致支持細(xì)胞粘附的丟失，從而干擾支持細(xì)胞緊密連接功能?？傊琍-糖蛋白能與FAK發(fā)生作用從而產(chǎn)生Occludin/ZO-1/FAK/P-糖蛋白調(diào)節(jié)復(fù)合體。將P-糖蛋白基因敲除后會(huì)使支持細(xì)胞之間的血睪屏障緊密連接出現(xiàn)漏洞，其機(jī)制是通過(guò)改變由FAK引起的閉合蛋白/ZO-1的蛋白質(zhì)復(fù)合物的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而影響內(nèi)吞蛋白囊泡狀態(tài)并弱化屏障作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.2.2FAK與精子釋放 排精是成熟精子從支持細(xì)胞釋放的過(guò)程。在早期排精之前，精子是靠apical ES粘附到支持細(xì)胞。先前研究顯示ES這種粘附連接，在精子釋放前30 h會(huì)被移除，推測(cè)還有一種新的未被識(shí)別的粘附連接調(diào)節(jié)精子釋放[30]。免疫組化分析表明，α6整合蛋白和FAK的磷酸化形式FAK-Tyr397，在ES移除之后直到精子釋放，一直存在于晚期精子和支持細(xì)胞之間。這兩種蛋白都和激素介導(dǎo)的排精失敗導(dǎo)致的精子保留有關(guān)。β1整合蛋白可能是調(diào)節(jié)精子與支持細(xì)胞分離復(fù)合物的一個(gè)組成成分，它存在于精子釋放期間，還存在于ES移除之后，直到精子與支持細(xì)胞分離，它都存在于精子頭部的背面。在成年大鼠體內(nèi)由于激素抑制的保留精子(未被成功釋放的精子)處能夠看到。ILK和FAK是兩種存在于睪丸中與β1整合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用的兩種激酶[31](圖3)。免疫定位研究表明FAK并不存在于排精位點(diǎn)，但用抗FAK特定磷酸化形式的抗體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它的磷酸化形式P-FAK在排精期間存在于精子周?chē)?，能與β1整合蛋白免疫共沉淀。免疫組化顯示，在排精期間，F(xiàn)AK-Tyr397存在于階段七、階段八、第19步驟中，環(huán)繞精子頭的背側(cè)。α6整合蛋白、β1整合蛋白、FAK-Tyr397這些蛋白存在于精子釋放的最后時(shí)刻，也存在于性激素抑制的未被釋放的精子周?chē)?，表明這些蛋白在精子釋放期間起著重要作用(圖3)。性激素抑制而導(dǎo)致的精子釋放失敗也說(shuō)明激素可調(diào)節(jié)α6β1整合蛋白和磷酸化FAK的復(fù)合物釋放精子。

圖3 相關(guān)分子參與的精子分離的示意圖[32]

(A)在階段VII期間，ES連接和相關(guān)的微管相聯(lián)系。α6β1整合蛋白存在于支持細(xì)胞的質(zhì)膜，支持細(xì)胞的質(zhì)膜還和精子的背側(cè)相聯(lián)系，磷酸化的FAK和整合蛋白相關(guān)的激酶ILK大概通過(guò)β1整合蛋白與之相聯(lián)系。(B)在階段VIII精子分離之前ES連接連同ILK一同被移走。相反，包含有磷酸化FAK以及α6β1整合蛋白的“分離復(fù)合物”存在于精子和支持細(xì)胞之間，微管存在于支持細(xì)胞胞質(zhì)莖中，但此時(shí)卻和精子沒(méi)有聯(lián)系。

2.2.3FAK與精子獲能 精子獲能對(duì)于哺乳動(dòng)物是成功受精的關(guān)鍵，精子獲能的標(biāo)志之一就是酪氨酸磷酸化(PY)的全面增加[33]。為了探究FAK家族蛋白是否參與種馬精子的酪氨酸磷酸化過(guò)程，González-Fernández等將不同濃度(1 μM, 5 μM 和10 μM)的FAK抑制劑 (PF-431396)[34]，分別添加到不含鈣和含鈣但不含鈣調(diào)抑制劑的兩組培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示兩組的酪氨酸磷酸化的增加都被抑制[35]。在不含鈣和含鈣但不含鈣調(diào)抑制劑的兩組培養(yǎng)基中均能檢測(cè)到PTK2和PTK2B的磷酸化，但在添加了FAK抑制劑的上述兩種培養(yǎng)基中，F(xiàn)AK家族的兩種蛋白的磷酸化都被抑制。上述結(jié)果顯示FAK家族蛋白參與了種馬精子的獲能，研究結(jié)果還表明在種馬精子中有兩種獨(dú)立的途徑介導(dǎo)酪氨酸磷酸化，PRKA途徑和不涉及PRKA的鈣刺激途徑。此外，在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中，PTK2B可被CAMK2激活[36]，所以人們推測(cè)CAMK2是PRKA的靶標(biāo)，CAMK2作為PRKA和FAK的信息傳遞者，F(xiàn)AK是PRKA途徑和鈣刺激途徑的作用位點(diǎn)。PRKA途徑和鈣刺激途徑在獲能條件下有很多蛋白經(jīng)歷酪氨酸磷酸化，所以激酶特異性對(duì)選擇性細(xì)胞信號(hào)是關(guān)鍵的，F(xiàn)AK或許是這兩種途徑下游的其它酪氨酸激酶的激活劑。

2.2.4FAK與卵母細(xì)胞成熟FAK的激酶活性起初是在斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞中被檢測(cè)到[37]，F(xiàn)AK在卵母細(xì)胞中高表達(dá)，主要定位在卵母細(xì)胞皮質(zhì)[38]。免疫復(fù)合物激酶測(cè)試表明，斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞中總FAK激酶活性在受精時(shí)下降百分之五十。通過(guò)磷酸特異性位點(diǎn)的抗體可檢測(cè)到在減數(shù)第二次分裂后期卵母細(xì)胞皮質(zhì)的局部性激活，表明雖然FAK的總體活性在受精后下降，但是卻可能激活了局部的FAK激酶池。Steven Pelech等[39]在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中用抗體微陣列分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)和磷酸化，發(fā)現(xiàn)從GV期到MI期FAKSer-732 的磷酸化降低30%。相比之下，從MI到(減數(shù)第二次分裂)MII期間FAKSer-722、FAKSer-732磷酸化的分別增加60%、46%，用牛的卵母細(xì)胞做了抗體微陣列分析，發(fā)現(xiàn)豬和牛的卵母細(xì)胞FAKSer-722的磷酸化增加具有一致性變化。FAKSer-722的免疫印跡結(jié)果和抗體微陣列分析結(jié)果一致，說(shuō)明從MI期到MII期FAK的磷酸化增加，F(xiàn)AK蛋白激酶磷酸化參與卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂周期的調(diào)控。

2.2.5FAK與早期胚胎發(fā)育 在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中如缺乏FAK會(huì)死亡，表明了FAK的重要生理意義。FAK在早期發(fā)育過(guò)程中高度磷酸化，F(xiàn)AK在正常胚胎中的表達(dá)無(wú)所不在，但在中胚層中的表達(dá)尤為強(qiáng)烈。以FAK敲除的小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)交配后第7.5天時(shí)(E 7.5)胚胎仍表現(xiàn)正常，開(kāi)始形成正常的原腸胚，但到E 8.0的胚胎就表現(xiàn)異常，而且體外培養(yǎng)E 8.0胚胎的細(xì)胞遷移性下降，粘著斑位點(diǎn)的數(shù)目增多，表明FAK參與了粘著斑位點(diǎn)的更新[40]，到E8.5的胚胎異常表現(xiàn)特別明顯，前后軸的發(fā)育明顯弱化，中胚層發(fā)育缺陷，頭部間質(zhì)內(nèi)卷消失，不能形成脊索和體節(jié)。在非洲爪蟾的早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜中檢測(cè)到FAK，而磷酸化的FAK幾乎只存在于細(xì)胞膜上。FAT對(duì)于FAK靶定到粘著斑位點(diǎn)是必要的，但研究表明單獨(dú)的FAT或者FERM都不能使得FAK結(jié)合到胚胎細(xì)胞的細(xì)胞膜上[41]。已有證據(jù)表明FAK在粘著斑位點(diǎn)的更新過(guò)程中通過(guò)Rho的激活和抑制發(fā)揮了關(guān)鍵作用，F(xiàn)AK的FERM區(qū)域和發(fā)動(dòng)蛋白2的相互作用促進(jìn)了依賴(lài)微管的粘著斑位點(diǎn)的分解[42-45]。FAK敲除的小鼠表型和纖連蛋白及整合蛋白α5敲除的小鼠表型相似，也表現(xiàn)出中胚層衍生組織的缺陷，前后軸的縮短，和異常血管組織的發(fā)育。FAK敲除和纖連蛋白(FN)及整合蛋白α5敲除的表型相似，表明了FAK介導(dǎo)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的FN-整合蛋白信號(hào)。這些相互作用的干擾會(huì)導(dǎo)致徑向夾層的失敗和動(dòng)物極深層外胚層細(xì)胞的極性的丟失，這兩個(gè)過(guò)程都是外包需要的，形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)使得在原腸胚形成結(jié)束時(shí)外胚層變薄和擴(kuò)展將整個(gè)胚胎包括進(jìn)去[46]。Fonar等研究表明FAK在神經(jīng)胚形成過(guò)程中調(diào)節(jié)Wnt3a的表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)的特化[47]；Doherty等研究表明FAK在非洲爪蟾的心臟發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色[48]；Petridou[49]等構(gòu)造了一個(gè)包含F(xiàn)AK的FERM和C末端(FRNK)的結(jié)構(gòu)，命名為FF。在非洲爪蟾胚胎內(nèi)，F(xiàn)F主要定位在細(xì)胞-細(xì)胞接觸面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FERM對(duì)于募集FAK到新生粘附位點(diǎn)起作用，而且對(duì)于調(diào)節(jié)FAK對(duì)粘附斑位點(diǎn)的親和力和動(dòng)態(tài)也是重要的；FF能將磷酸化的FAK從粘著斑位點(diǎn)替換掉，體現(xiàn)了FF的顯性抑制活性；表達(dá)FF的細(xì)胞與對(duì)照組相比，粘著斑位點(diǎn)的數(shù)量和強(qiáng)度顯著增加，表明FF導(dǎo)致粘著斑位點(diǎn)更新的顯著降低，從而降低了細(xì)胞遷移；FF的表達(dá)導(dǎo)致了囊胚腔頂?shù)募雍?，外包和徑向夾層被阻斷，從而干擾外包過(guò)程，外包也可能與FF降低細(xì)胞遷移相關(guān)；FF表達(dá)導(dǎo)致了嚴(yán)重的原腸胚形成的缺陷，胚孔的關(guān)閉；胚胎的變小，彎曲和嚴(yán)重縮短，并導(dǎo)致大多數(shù)實(shí)驗(yàn)胚胎在蝌蚪期死去。關(guān)于FAK在多種多樣的發(fā)育過(guò)程的作用還有待于未來(lái)進(jìn)一步的研究。

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Advances in the FAK Gene Function Research

MA Yong1,2, JU Zhi-hua2,WANG Xiu-ge2, ZHANG Yan2,WANG Chang-fa2*,LIU Shu-zhen1*

(1.CollegeofLifeSciences,ShandongNormalUniversity,Jinan,Shandong250014,China; 2.DairyCattleResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan,Shandong250131,China)

FAK is a kind of cytoplasmic non-receptor protein tyrosine kinase which can regulate cell adhesion, apoptosis, differentiation and migration/mobile, cell cycle progression and connection reconstruction, etc. The study briefly reviewed the structure, the protein localization, kinds of variable spliceosome of FAK, illustrated its relationship with tumor, its role in the reproduction and early development, and proposed reasonable predictions for future FAK study in tumour and reproduction research.

FAK; tumor induction；reproduction

2014-07-09，

2014-11-19

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD19BO4)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(編號(hào)CARS-37)；山東省良種工程項(xiàng)目(2013LZ015-06)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CQ035)

馬勇(1990-),女,山東泰安人，碩士,研究方向：動(dòng)物學(xué)。E-mail：1095407574@qq.com

*[通訊作者] 王長(zhǎng)法(1967-)男，江蘇淮安人，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail:wangcf1967@163.com劉樹(shù)真(1972-)，女，山東聊城人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物發(fā)育機(jī)理。E-mail:shuzhen26@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)02-0001-08