沈珂 吳群英 蔣曉山

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)通常需要與其他蛋白質(zhì)或配體結(jié)合，形成瞬時或穩(wěn)定的復合體來實現(xiàn)其特定的功能，這種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人類、酵母、植物、線蟲等各種生物體的生命活動中起著十分重要的作用[1-4]。目前，PPI研究技術(shù)發(fā)展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等離子共振（SPR）、蛋白質(zhì)芯片等體外實驗技術(shù)，以及酵母雙雜交、蛋白質(zhì)片段互補（PCA）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 技術(shù)等。近十余年興起的雙分子熒光互補 （bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技術(shù)由于無需試劑檢測，能夠通過熒光顯微鏡在接近活細胞生理狀態(tài)的條件下快速、直觀地檢測目標蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的應用正日益廣泛。

1 BiFC技術(shù)的原理

Regan（2000）和Kerppola（2002）兩個研究小組最早發(fā)現(xiàn)和驗證了活細胞內(nèi) BiFC 現(xiàn)象。他們首先將1個GFP的突變子增強型黃色熒光蛋白（EYFP）從不同位點切開，然后將一組相互作用、同向平行的亮氨酸拉鏈（bFos和bJun）分別融合到從Ala154-Asp155之間切開的增強型黃色熒光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，導入大腸桿菌中共表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的一對融合多肽能夠在細菌細胞中產(chǎn)生YFP的熒光，他們將這個現(xiàn)象稱之為BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技術(shù)涉及的熒光蛋白已擴展到綠色熒光蛋白（GFP）、青色熒光蛋白（CFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其突變體等多種熒光蛋白，其原理都是將熒光蛋白在特定的位點切開，形成不發(fā)熒光的N和C端 2個多肽，稱為 N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。這2個片段在細胞內(nèi)共表達或體外混合時，不能自發(fā)組裝成完整的熒光蛋白。但是，當這2個熒光片段分別融合到一組有相互作用的目標蛋白上，在細胞內(nèi)共表達或體外混合這兩組融合蛋白時，由于目標蛋白質(zhì)的相互作用，熒光蛋白的2個互補片段在空間上互相靠近，重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，受到激發(fā)后發(fā)射出特定波長熒光（圖1）。

圖1 BiFC原理示意圖注：NGFP，GFP-N 端；CGFP，GFP-C端；A與B，能發(fā)生相互作用的一對蛋白

2 BiFC熒光蛋白的發(fā)展

早期用于BiFC 實驗的熒光蛋白主要為綠色熒光蛋白（GFP）及其突變體，包括 EYFP、EGFP、EBFP和ECFP[7-12]。由于它們必須在低溫下（30 ℃）預孵化0~24 h以促進互補片段組裝形成成熟的色團分子，因此，不利于生理條件下的胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究。2004-2008年，可應用于生理條件下的黃色熒光蛋白Citrine和Venus以及青色熒光蛋白Cerulean熒光蛋白被相繼引入BiFC技術(shù)[13]。2006年，Lin等[14]利用紅色熒光蛋白 DsRed和eqFP578發(fā)展而來的mPlum，mKate，mKate2和Katushka熒光蛋白，構(gòu)建了一組遠紅光熒光蛋白（far-red fluorescent proteins，F(xiàn)RFP）BiFC 系統(tǒng)。由于遠紅光能量低、穿透力強、不易引起細胞自發(fā)熒光和不易被細胞吸收，因此，能夠克服在哺乳動物中無法實現(xiàn)熒光蛋白在組織成像的問題，在哺乳動物的組織成像中具有巨大的應用前景。2010年，梳狀珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類似于GFP的綠色熒光蛋白Dronpa[15]。Dronpa猶如一個光開關，在490 nm照射下發(fā)射出綠色熒光，而405 nm的波長照射則會使其猝滅。目前，以Dronpa為基礎BiFC系統(tǒng)已用于揭示細胞核與細胞質(zhì)間轉(zhuǎn)錄蛋白的作用機制、轉(zhuǎn)錄蛋白功能和蛋白質(zhì)二聚化等的研究[16-18]。

3 BiFC技術(shù)在PPI研究中的應用

BiFC涉及的熒光蛋白不僅容易檢測到BiFC信號，還可通過對可視化的熒光進行定量從而確定蛋白質(zhì)相互作用的強弱。熒光蛋白片段一旦重建成完整熒光蛋白后大多數(shù)不可逆，因而特別適用于檢測亞細胞環(huán)境中微弱的（mM級別） 和瞬時的相互作用[16]。2003年，Hu等[17]將 GFP，YFP，CFP，BFP分別在 155位或173位氨基酸處切開產(chǎn)生的N端片段和C端片段任意配對，進行熒光互補檢測，首次將BiFC技術(shù)觀應用于活細胞中PPI研究。

2014年，任頁玫等[18]為了解S-periaxin蛋白在施旺氏細胞內(nèi)分子狀態(tài)，利用基于紅色熒光蛋白mCherry的BiFC系統(tǒng)構(gòu)建原核雙分子熒光互補分析載體 pS-periaxin-Cherry（1-159）和 pmCherry（160-237）-S-periaxin，真核雙分子熒光互補分析載體 pmyc-S-periaxin-MN1-159和 pMC160-237-S-periaxin ， 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在真核及原核系統(tǒng)均觀察到在 S-periaxin 蛋白介導下將mCherry 熒光蛋白的兩個片段重新組裝形成熒光復合物，發(fā)出紅色熒光，證明S-periaxin蛋白存在同源蛋白相互作用。郭曉令等[19]為了驗證PAC1同源二聚化現(xiàn)象，采用基于EYFP黃色熒光蛋白的BiFC系統(tǒng)，用帶有EYFP N端基因標記的PAC1與帶有EYFP C端基因標記的PAC1共轉(zhuǎn)染 CHO細胞，發(fā)現(xiàn)完整的EYFP熒光信號，表明PAC1可發(fā)生同源二聚化。

細胞內(nèi)存在著多種信號轉(zhuǎn)導通路，借助BiFC技術(shù)，對信號級聯(lián)反應中蛋白質(zhì)的相互作用進行觀察與分析，可以進一步闡明信號通路的傳遞機制及生理功能提供了有力的支持[20-22]。K-Ras蛋白是很多信號轉(zhuǎn)導通路中的分子開關，參與多種細胞生物學過程的信號傳導及其調(diào)控，在細胞生長、增殖、分化和癌變過程中扮演著重要角色。一般認為在信號傳遞過程中，位于細胞膜上的Ras蛋白將Raf1從胞漿招募到胞膜。2012年，Li等[23]通過BiFC實驗證實，Raf1和K-Ras在細胞內(nèi)的定位分別在胞漿和胞膜，當Raf1從胞漿轉(zhuǎn)運到細胞膜并與膜上的K-Ras結(jié)合形成復合物時，細胞內(nèi)MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應才會啟動；該研究還認為K-Ras/Raf1復合物的膜定位并不完全依賴K-Ras，K-RAS/Raf1的形成起著在這一過程中起關鍵作用，揭示了Raf1從胞漿到胞膜轉(zhuǎn)運的機制。

2014年，Yu等[24]運用BiFC證實PAC1為一種具有內(nèi)在二聚體活性的配體非依賴性細胞表面受體，且其二聚化與Wnt/β-catenin信號通路相關，揭示了PAC1二聚體依賴的基礎活性，有助于理解PAC1的生理和病理作用，促進了PAC1靶向藥物的發(fā)展。

4 多色熒光 BiFC 技術(shù)

多色熒光互補技術(shù)（multicolor fluorescence complementation，MFC）彌補了BiFC 技術(shù)只能檢測兩兩蛋白質(zhì)之間的相互作用的不足。Hu等在雙分子熒光復合物之間的光譜差異的基礎上，將bJun，bFos bATF2共 表 達 等 量 的bJunCC155和bFosCN173，bATF2YN173，所產(chǎn)生的青色熒光與共表達bJunCC155和bFosCN173相當，而黃色熒光卻只有共表達bJunCC155和bATF2YN173的不到1%。換 用 bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553實 驗，得到相同結(jié)果。再次共轉(zhuǎn)bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553入細胞，并過表達 bJunCC155，就能同時檢測到青色熒光和黃色熒光。表明bFos，bATF2都能與bJun發(fā)生相互作用，并且bFos的結(jié)合能力遠強于 bATF2，在bFos和bATF2同時存在時，bJun優(yōu)先與bFos結(jié)合[17]。

5 BiFC-FRET技術(shù)檢測多種蛋白質(zhì)間的相互作用

傳統(tǒng)的BiFC技術(shù)限于兩個分子之間的相互作用，有一定的局限性，因為很多信號蛋白是以寡聚體形式發(fā)揮作用。為了克服這個難題，2008年，Shyu等[25]將BiFC技術(shù)和FRET技術(shù)結(jié)合起來，建立了基于雙分子熒光互補的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（BiFC-FRET），該技術(shù)采用青色熒光蛋白Cerulean 和1個基于黃色熒光蛋白Venus的BiFC系統(tǒng)聯(lián)用，能同時檢測3個蛋白之間的相互作用。其做法是將 bJun和bFos分別和Venus熒光蛋白的N端C端片段相連，Cerulean 蛋白與NFAT1蛋白相連，bJun和bFos 的相互作用使得Venus蛋白重建；當和 Cerulean 融合的蛋白NFAT1和bJun和bFos異源二聚體相互作用時，Cerulean 可以作為供體將能量共振轉(zhuǎn)移至重建后的 Venus 熒光蛋白，實現(xiàn)3個蛋白質(zhì)相互作用的共檢測。由于熒光互補技術(shù)依賴于熒光蛋白的自身性質(zhì)，并非所有熒光蛋白都能用于該項技術(shù)，因此蛋白選取和熒光性質(zhì)檢測是該技術(shù)的關鍵[26]。

6 BiFC 在流式細胞術(shù)定量分析中的應用

Morell等[27]（2007年）采用流式細胞術(shù)對BiFC熒光蛋白復合物的熒光信號進行檢測，創(chuàng)建了一種實時檢測細胞內(nèi)PPI的研究方法，即雙分子熒光互補流式分析技術(shù)（bimolecular fluorescent complementationflow cytometry， BiFC-FC）。由于流式細胞儀（FACS）能夠?qū)晒庑盘柕年栃约毎麛?shù)和平均熒光強度進行定量分析，且能檢測到較弱的熒光信號，因此其檢測結(jié)果較傳統(tǒng)的熒光顯微鏡觀察方法更為可靠。最近報道了一種由DsRed-Experss2突變而來 E2-Crimson，激發(fā)波長為611 nm，發(fā)射波峰為646 nm，對細胞無毒性，能夠用于超高分辨率受激發(fā)射減損（stimulated emission depletion，STED）顯微鏡觀察，在流式細胞檢測中具有很好的應用前景[28]。Parvatiyar等利用BiFC-FC完成了HCV蛋白結(jié)構(gòu)域與干擾素誘導基因之間相互作用的篩選，建立了病毒蛋白與宿主因子相互作用的高通量篩選方法[29]。目前，應用流式細胞技術(shù)對單個細胞內(nèi)的BiFC信號進行定量分析，正成為活細胞BiFC實驗的標準手段。

7 BiFC的缺點及改進

BiFC系統(tǒng)中重新形成完整活性蛋白的2個互補熒光蛋白片段，往往需要幾分鐘到幾小時的自體催化才能完成，因此觀察到的熒光信號滯后于蛋白質(zhì)的相互作用過程，不適用于實時監(jiān)測 PPI 及對蛋白復合體進行動力學分析[30-31]。另外，兩個不發(fā)光的BiFC熒光片段往往會自發(fā)融合成互補蛋白，導致背景熒光的產(chǎn)生并且降低信噪比（S/N）比。Liu等[32]采用一個新的 BEVL-BiFC系統(tǒng)——將mLumin 1-151（Ln）和mLumin 151-233（Lc）兩個熒光片段在雙表達載體中構(gòu)建BiFC 體系，結(jié)果表明該系統(tǒng)可以明顯降低BiFC體系中因非特異性結(jié)合而導致的假陽性。Nakagawa等發(fā)現(xiàn)，特定位點缺失和定點突變可有效減少BiFC的假陽性結(jié)果[33]。最近報道，哺乳動物細胞中以Venus熒光蛋白（共238個氨基酸）為基礎的BiFC試驗中，對片段VN155（N堿基1-154黃色），VC155（堿基1-154藍綠色）第7和第10號β折疊上的堿基進行定點突變，當V150L、I152L、L201V、和L207V這幾個位點被替換掉后，將結(jié)合亮氨酸拉鏈實驗構(gòu)成的互補片段bJun-VN/bFos-VC轉(zhuǎn)染到COS-1細胞后，發(fā)現(xiàn)自發(fā)熒光明顯減少，信噪比明顯改善[34]，值得注意的是V152L突變體在以Cerulean為熒光蛋白的BiFC實驗中對信噪比的影響不大[35]，這提示筆者根據(jù)不同的BiFC系統(tǒng)應選擇不同的突變體。在陰性對照選取困難的情況，采用競爭性BiFC技術(shù)不失為一種有效手段。如在同向平行的亮氨酸拉鏈bJun-YN155和bFos-YC155融合蛋白實驗中[6]，當加入大量的單一亮氨酸肽鏈bJun或bFos后熒光互補現(xiàn)象被抑制，更進一步證明了bJun和bFos之間的結(jié)合反應。

8 展望

BiFC技術(shù)作為一種新近發(fā)展起來用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法，不僅能夠直觀地檢測PPI、以及蛋白質(zhì)基團之間相互作用的強弱關系，而且還可以檢測受體之間自身交聯(lián)反應，有助于闡明這些受體的功能和作用機制然而，BiFC技術(shù)本身仍存在局限性，如基于熒光蛋白的BiFC信號被認為是不可逆的[36]，雖然它的不可逆性有助于研究瞬時和較弱的蛋白相互作用現(xiàn)象，但也限制觀測動態(tài)PPI。隨著BiFC研究的深入和新的性能優(yōu)異的互補片段的發(fā)現(xiàn)，BiFC技術(shù)必將在PPI研究中具有更加廣泛的應用前景。

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