蘇澤智，李亞新，魏海燕，雷佳琦，劉 琦，朱林煒，慕 勇，李豐隆，何 錦，楊公社，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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稀釋粉對(duì)豬精液常溫保存效果的研究

蘇澤智，李亞新，魏海燕，雷佳琦，劉 琦，朱林煒，慕 勇，李豐隆，何 錦，楊公社，胡建宏*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

為了開發(fā)豬精液常溫保存新型稀釋粉，通過檢測(cè)精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性以及超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)產(chǎn)生量等指標(biāo)，分析常溫保存稀釋粉對(duì)豬精液的保存效果的影響。結(jié)果表明，在常溫保存條件下，自配稀釋粉保存豬精液5 d時(shí)間內(nèi)，精子活率平均為0.63，精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別達(dá)到78.4%和48.6%；SOD活力、H2O2產(chǎn)生量和MDA產(chǎn)生量分別是177.39 IU/mL、86.28 mmol/mL和9.36 nmol/mL，可以在生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中應(yīng)用。

常溫保存;豬精液;稀釋粉;保存效果

隨著豬人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，精液的保存技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。精液的稀釋保存是豬人工授精成敗的關(guān)鍵，其保存方法包括常溫保存、低溫保存和冷凍保存三種。由于豬低溫保存與冷凍保存技術(shù)還不成熟，因而人工授精中以常溫保存的為主，占到使用總量的99%[1]。

豬精液常溫保存稀釋粉是用于配制適宜豬精子存活、保持其受精能力的稀釋液，為精子提供代謝所需的能量物質(zhì)、適當(dāng)?shù)腜H和滲透壓環(huán)境，以保證精子在體外具有較長(zhǎng)的存活時(shí)間及結(jié)構(gòu)功能的完整。豬精液常溫保存的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB23238-2009)要求精液在稀釋保存3天后的精子活力不低于0.6[2]。目前國內(nèi)外豬精液常溫保存的稀釋粉配方種類很多，但由于質(zhì)量控制不合格和配方的差異，一些稀釋粉存在應(yīng)用效果不穩(wěn)定、有效保存時(shí)間達(dá)不到國標(biāo)要求、且成本較高等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了豬人工授精技術(shù)的發(fā)展[3]。因此，為了探究一種保存效果可靠、成本低廉的稀釋粉，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出一種新的稀釋粉配方，并用該配方對(duì)豬精液進(jìn)行常溫保存，分析精子活率、有效存活時(shí)間、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生量和丙二醛(MDA)產(chǎn)生量等，以便對(duì)在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 精液來源 試驗(yàn)精液來自于楊凌區(qū)養(yǎng)豬服務(wù)站20月齡健康成年的長(zhǎng)白種公豬。用手握法采精，收集中段濃縮部分，經(jīng)過濾后保存于保溫杯中，40 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在37.5 ℃下鏡檢，并用分光光度計(jì)在550 nm處進(jìn)行比色，計(jì)算精子密度。選擇色澤和氣味正常，精子活率在0.8以上，精子數(shù)密度為3×108～5×108/mL的精液用于試驗(yàn)研究，并將部分原精留作空白組，檢測(cè)精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性，以及SOD活性、H2O2和MDA的產(chǎn)生量。

1.1.2 試劑藥品 葡萄糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二鉀(EDTA2K)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、慶大霉素、N-乙酰半胱氨酸、牛血清白蛋白(BSA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和SOD、H2O2、MDA試劑盒。

1.1.3 稀釋粉成分 稀釋粉配方主要成分包括海藻糖、EDTA、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、N-乙酰半胱氨酸、Tris、BSA、氨基酸、SOD、CAT。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 電熱恒溫烘箱、電子天平、磁力攪拌儀、光學(xué)顯微鏡、PH測(cè)定儀、17 ℃精液保存箱、高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

1.1.5 稀釋液的配制 按配方規(guī)定的劑量準(zhǔn)確稱量每種藥品于干燥滅菌的大燒杯中，加入1 L雙蒸水，放置磁力攪拌儀上加熱攪拌，待各成分充分溶解后，封口并在室溫下靜置30 min，使所有成分在溶液中均衡分布，電解質(zhì)得到穩(wěn)定。然后用0.22 μm進(jìn)口濾器過濾溶液于干燥滅菌細(xì)口瓶中，加入配方規(guī)定劑量的抗生素后，封口待用。

1.1.6 精液的稀釋與保存 將稀釋液置于37 ℃的水浴鍋中升溫備用，按照1∶5的稀釋倍數(shù)將等溫稀釋液沿容器壁緩慢加入檢測(cè)合格的精液中，輕輕搖晃混勻。然后用四層毛巾包裹緩慢降溫，室溫放置2 h后連同毛巾一起放入17 ℃恒溫保存箱中保存，每隔12 h輕輕搖動(dòng)精液1次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 測(cè)定原精和稀釋后每24 h的精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性，以及SOD活性、H2O2和MDA產(chǎn)生量，綜合分析對(duì)精液保存的效果。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 精子活率 直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占視野中精子總數(shù)的百分率。精子活率的測(cè)定采用目測(cè)法。

1.3.2 精子頂體完整率 對(duì)精子頂體染色，在顯微鏡下觀察頂體完整的精子所占的比例。

1.3.3 精子質(zhì)膜完整率 利用精子尾部低滲腫脹試驗(yàn)(hypo-osmotic swelling test，HOST)，在顯微鏡下觀察腫脹彎尾的精子比例。

1.3.4 SOD活性、H2O2和MDA產(chǎn)生量 使用SOD試劑盒、H2O2試劑盒和MDA試劑盒測(cè)定，檢測(cè)方法根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)過程中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性

稀釋保存不同時(shí)間后的豬精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性見表1。

表1 稀釋粉對(duì)豬精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Different lower case superscripts in the same row indicate significant difference (P<0.05), and the same superscripts indicate not significant (P>0.05).

由表1可知，精液保存的第1、2天精子活率由0.807下降至0.783，差異不顯著(P>0.05)，說明稀釋過程中，該配方對(duì)精子活率的損傷不大。但從第3天起，精子活率開始快速下降，這可能與稀釋液體系中精子代謝產(chǎn)生的廢棄物堆積增多有關(guān)。精液保存的第5天，精子活率為0.63，精子有效存活時(shí)間達(dá)到5 d，表明本稀釋劑配方可以較長(zhǎng)時(shí)間的保存精液。精子頂體完整性和質(zhì)膜完整性隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)，表明本配方在保護(hù)精子頂體和質(zhì)膜完整性方面還需要做出改善。

2.2 稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液SOD活性的影響

由圖1可知，原精SOD活性為402.05 IU/mL，稀釋后下降到337.55 IU/mL，與原精相比顯著降低(P<0.05)，因?yàn)橄♂屪饔檬筍OD的有效濃度降低。在保存的第1、2、3天差異不顯著(P>0.05)，在保存的第4、5天又顯著下降(P<0.05)。這是因?yàn)殡S著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精液中代謝產(chǎn)物逐漸積累，氧化的中產(chǎn)物無法及時(shí)清除而破壞了氧化還原的平衡，精子質(zhì)膜被破壞，精子開始凋亡無法維持高水平的SOD活性，并且這種作用會(huì)產(chǎn)生惡性循環(huán)的效果。

圖1 自配稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液SOD活性的影響

Fig.1 Effect of test formulation on SOD activity of spermpreserved at normal temperature

圖2 稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液H2O2產(chǎn)生量的影響

Fig.2 Effect of dilute powder on H2O2 yield of sperm pre-served at normal temperature

2.3 稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液H2O2產(chǎn)生量的影響

由圖2可知，試驗(yàn)配方稀釋粉保存精液H2O2產(chǎn)生量在稀釋后由60.28 mmol/mL增加到63.13 mmol/mL，差異顯著(P<0.05)。并且保存精液H2O2產(chǎn)生量在有效保存時(shí)間內(nèi)每一天都比前一天顯著增加(P<0.05)。精液中的H2O2這種氧化中產(chǎn)物由于SOD的作用而產(chǎn)生，但同時(shí)又被CAT清楚，在公豬體內(nèi)維持著平衡狀態(tài)。而在常溫保存條件下氧化作用增強(qiáng)，H2O2無法及時(shí)清除而被積累。

2.4 稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液MDA產(chǎn)生量的影響

圖3 自配稀釋粉對(duì)常溫保存豬精液MDA產(chǎn)生量的影響

由圖3可知，試驗(yàn)配方稀釋粉保存精液MDA產(chǎn)生量在稀釋后由5.60 nmol/mL變化到6.21 nmol/mL(P<0.05)。并且試驗(yàn)配方對(duì)常溫保存豬精液MDA產(chǎn)生量在有效保存時(shí)間內(nèi)每一天都比前一天顯著增加(P<0.05)。這主要是因?yàn)樵诒４娉跗?，精子具有較強(qiáng)的抗氧化能力，氧化損傷水平較低，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子氧化還原體系平衡被打破，破壞了精子本身的結(jié)構(gòu)，同時(shí)抗氧化酶的活性下降或喪失，使得氧化加劇，精子損傷加劇，導(dǎo)致精子MDA水平逐漸升高。

3 討 論

3.1 影響稀釋粉保存效果的因素

3.2 稀釋粉保存豬精液的效果

目前常檢測(cè)的保存豬精液效果的質(zhì)量指標(biāo)有活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率和抗氧化能力等。本稀釋劑配方中使用EDTA、Tris等成分都具有螯合特性，能夠抑制金屬離子在過氧化反應(yīng)過程中所起的催化作用，以防止細(xì)胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)以及保存過程中自發(fā)的精子頂體反應(yīng)的發(fā)生。另外，精子質(zhì)膜的完整性，也是影響受胎率的一個(gè)重要因素，精子質(zhì)膜的重要性在于它能夠有選擇地運(yùn)輸分子。稀釋粉中的糖類，不僅可以為精子提供代謝所需的能量，同時(shí)也是一種重要的保護(hù)物質(zhì)[7]。洪潔赟等[8]認(rèn)為糖類能通過對(duì)質(zhì)膜的穩(wěn)定從而發(fā)揮保護(hù)作用。本稀釋粉配方中添加的海藻糖正是希望能通過其羥基可以與精子膜磷脂中的磷酸根結(jié)合，置換周圍的水分子，提高精子對(duì)滲透壓的耐受性從而起到保護(hù)和穩(wěn)定質(zhì)膜的作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示自配稀釋粉保存精液5 d頂體完整性78.40%，高于徐振軍等[7]用Ⅱ號(hào)液和Ⅳ號(hào)液稀釋精液保存5 d頂體完整性65%和60%，證實(shí)了本配方中加入的糖類、EDTA、Tris等螯合劑和緩沖物質(zhì)，對(duì)延長(zhǎng)精液保存時(shí)間具有顯著效果。

3.3 豬精液常溫保存稀釋粉的抗氧化能力

精子存活時(shí)間與稀釋液的氧化還原指數(shù)密切相關(guān)[9]，本試驗(yàn)結(jié)果表明該配方稀釋粉保存精子有效時(shí)間達(dá)到5.4 d，其原因可能是含有適宜的BSA、SOD、CAT和N-乙酰半胱氨酸等物質(zhì)。BSA具有維持滲透壓、緩沖pH、充當(dāng)載體還原酶的穩(wěn)定劑以防止酶的分解和非特異性吸附等作用[10]，其對(duì)延長(zhǎng)豬精液保存時(shí)間有顯著效果。SOD和CAT的配伍使用，使稀釋精液體系的抗氧化保護(hù)作用得到顯著加強(qiáng)，SOD可將精液中O2-轉(zhuǎn)化成H2O2，進(jìn)一步被CAT還原為不造成氧化損傷的H2O等產(chǎn)物。N-乙酰半胱氨酸分子中的巰基與體內(nèi)活性氧自由基有很強(qiáng)的結(jié)合能力[11]，本試驗(yàn)對(duì)精子質(zhì)膜完整性的測(cè)定表明，添加N-乙酰半胱氨酸對(duì)豬精子的質(zhì)膜有很大保護(hù)作用，其結(jié)果與徐德祥等[12]的N-乙酰半胱氨酸對(duì)外源性H2O2和內(nèi)源性O(shè)2-引起的精子損傷有明顯的保護(hù)作用基本一致。試驗(yàn)表明，本配方稀釋粉中選擇加入的蛋白保護(hù)劑、活性酶和抗氧化劑，都能夠充分發(fā)揮作用，抑制精子質(zhì)膜的過氧化損傷，產(chǎn)生了有效延長(zhǎng)精液保存時(shí)間的效果。

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Effect of Diluent Powder on Normal-temperature Storage of Boar Semen

SU Ze-zhi, LI Ya-xin, WEI Hai-yan, LEI Jia-qi, LIU Qi, ZHU Lin-wei, MU Yong, LI Feng-long,HE Jin, YANG Gong-she, HU Jian-hong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

In order to develop a new diluent for boar semen stored at normal temperature, sperm motility, acrosome integrity rate, plasma membrane integrity, superoxide dismutase (SOD) activity, yield of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA) were measured to assess the influence of diluted powder to boar semen quality. The results showed that stored in mixed diluent for 5-d at normal temperature, sperm motility averaged 0.63, acrosome integrity and plasma membrane integrity rate were 78.4% and 48.6%. SOD activity, yield of H2O2and MDA were 177.39 IU/mL, 86.28 mmol/mL and 9.36 nmol/mL,respectively, indicating that the mixed diluent can be applied in the production.

normal temperature storage；boar semen；dilute powder；storage effect

2014-06-14，

2014-07-24

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)；楊凌示范區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NY-22)；西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410712005)。

蘇澤智(1990-)，男，陜西西安人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物生殖生理調(diào)控方面的研究。E-mail：846245089@qq.com

*[通訊作者] 胡建宏(1969-)，男，陜西白水人，博士，教授，主要從事家畜生殖生理調(diào)控方面的教學(xué)與科研工作。 E-mail：hjh19732008@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)01-0059-04