王 偉

(甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，734000)

本實(shí)驗(yàn)將以上兩組不同的血清對Sp2/0—Ag14細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過測定細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生長曲線，得出細(xì)胞在不同時(shí)期的生長密度并以此為依據(jù)來判斷不同血清培養(yǎng)的細(xì)胞生長效果。生長曲線包括三個(gè)時(shí)期：滯留期：此期為分種后的初期，不分裂繁殖，細(xì)胞數(shù)目不增加，甚至略減，一般需24～96小時(shí)，指數(shù)期：這是細(xì)胞繁殖的旺盛期，一般為3～5天有時(shí)也把它叫潛伏期，平臺期：此時(shí)細(xì)胞已達(dá)飽和濃度，停止生長繁殖，要及時(shí)分種傳代，否則將逐漸衰亡[2]。在測定細(xì)胞生長曲線的同時(shí)，取細(xì)胞達(dá)到最大濃度前的細(xì)胞數(shù)與達(dá)到這一數(shù)量所需的時(shí)間計(jì)算出細(xì)胞的倍增時(shí)間[3]，這種方法相對于細(xì)胞計(jì)數(shù)法[4]來說，能有效的減少實(shí)驗(yàn)誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而使獲得的數(shù)據(jù)更加客觀，可靠。

1 材料

1.1 設(shè)備與儀器

100 ml螺口培養(yǎng)瓶,10ml刻度吸管,1ml刻度吸管,彎頭吸管,二氧化碳培養(yǎng)箱，10ml注射器，長針頭，1000ul移液器，移液尖，恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡燒杯，100ml玻璃瓶，三角瓶（帶玻璃珠），鑷子，眼科剪，平皿，解剖板，大頭針，漏斗（帶紗布），超凈工作臺。

1.2 試劑

RPMI1640培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，3%谷氨酰胺，1.1%丙酮酸鈉，7.5%碳酸氫鈉，0.25%胰蛋白酶，0.4%乳歐液，酶稀釋液，慶大霉素，75%酒精，Hanks’液。3月齡采血牛血清，14日齡采血牛血清。

2 方法及步驟

2.1 方法

2.1.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)法

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。首先取待測及對照的細(xì)胞懸液各0.1ml，然后滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，于低倍鏡下計(jì)數(shù)四角的4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞。計(jì)數(shù)過程中，對大方格的邊緣壓線細(xì)胞按數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，兩次反復(fù)計(jì)算誤差不超過10%。細(xì)胞濃度按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞濃度=4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)=細(xì)胞數(shù)/ml[7]

2.1.2 細(xì)胞倍增時(shí)間法

細(xì)胞倍增時(shí)間的測定：按生長曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。取細(xì)胞峰值前一天計(jì)的得數(shù)（Y），接種細(xì)胞數(shù)（X），及生長時(shí)間（T）計(jì)算。

倍增時(shí)間=T/A A=log2Y/X[6]

2.2 步驟

將3%谷氨酰胺和1.1%丙酮酸鈉按1%比例加入RPMI 1640培養(yǎng)液中，用7.5%碳酸氫鈉調(diào)培養(yǎng)液的PH值為7.2-7.4。取Sp2/0-Ag14種細(xì)胞一瓶,用彎頭吸管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶細(xì)胞面，制成細(xì)胞懸液,分種到兩個(gè)100ml培養(yǎng)瓶中，9ml培養(yǎng)液/瓶，分別加入兩組牛血清（10%）1ml，放入5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱擰松瓶蓋進(jìn)行開放式培養(yǎng),對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),待細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml時(shí)將細(xì)胞接種至96孔板中，每隔24h計(jì)數(shù)一次,連續(xù)計(jì)數(shù)一周，紀(jì)錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[5]。細(xì)胞的最大增值濃度不低于106/ml。將記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總，繪制出細(xì)胞生長曲線，根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間。

3 結(jié)果及分析

從表1和圖1可以看出,在細(xì)胞接種24-48h之內(nèi)，由于細(xì)胞適應(yīng)性及培養(yǎng)液的理化特征不穩(wěn)定等因素的影響，A組血清培養(yǎng)的細(xì)胞濃度小于B組血清，但當(dāng)培養(yǎng)液特性及細(xì)胞適應(yīng)性達(dá)到穩(wěn)定之后，A組血清培養(yǎng)的細(xì)胞濃度開始上升，在對數(shù)期已檢血清的細(xì)胞濃度上升較快，在達(dá)到峰值前后，細(xì)胞濃度已明顯高于B組血清，在細(xì)胞濃度達(dá)到峰值之后，由于細(xì)胞培養(yǎng)液中有毒物質(zhì)的積累，及細(xì)胞之間的條件抑制[8]細(xì)胞濃度開始下降，A組血清細(xì)胞的生長曲線下降相對較慢。據(jù)圖表可得：Y對=417500/mlX對=10000/mlT對=120h峰值對＝1332500/ml；Y檢＝485000/mlX檢=10000/mlT檢=120h峰值檢=1465000/ml；倍增時(shí)間對=T/log2Y/X=17.8h；倍增時(shí)間檢＝T/log2Y/X=17.1h。數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過檢測后的血清在培養(yǎng)細(xì)胞過程中的增值時(shí)間低于未經(jīng)過檢測的血清。

表1 24-168h細(xì)胞濃度（單位：萬/ml）

圖1Sp2/0-Ag14細(xì)胞生長曲線圖

4 討論

通過以上數(shù)據(jù)可以看出：B組的細(xì)胞培養(yǎng)倍增時(shí)間為17.1小時(shí)，低于A組的細(xì)胞培養(yǎng)倍增時(shí)間17.8小時(shí)，倍增時(shí)間越短說明細(xì)胞生長的越快。

細(xì)胞計(jì)數(shù)法雖然簡便，宜行，但在細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中，需要借助于倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)液中同時(shí)存在死細(xì)胞及其它一些雜質(zhì)，容易造成誤差，且細(xì)胞計(jì)數(shù)要使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器，長時(shí)間進(jìn)行顯微鏡下的觀察，容易造成視疲勞，從而導(dǎo)致誤差。而采用細(xì)胞生長曲線測定法，雖然也要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，但細(xì)胞生長曲線的測定是對細(xì)胞生長趨勢的測定，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，從而使結(jié)果更加客觀，精確。對細(xì)胞倍增時(shí)間測定時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，往往是用細(xì)胞生長的峰值，但實(shí)際所記得的峰值往往與理論上的不一致，且此時(shí)期細(xì)胞也不一定處于良好的生長期。我們用峰值前一天細(xì)胞生長基本處于良好的對數(shù)生長期時(shí)計(jì)得的數(shù)來計(jì)算倍增時(shí)間，其結(jié)果更近于理論上的值[10]

5 結(jié)論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：采用14日齡采血牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)于采用3月齡血清；采用細(xì)胞倍增時(shí)間法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)效果評價(jià)要優(yōu)于細(xì)胞計(jì)數(shù)法。

[1]GibcoBRLCatalogusandReferenceGuide.1990.4：68.

[2]張卓然.培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004.8：41.

[3]張卓然.實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].人民衛(wèi)生出版社，1999:34.

[4]P1ye.D.,J.BiolStand.1975.3:83-87.

[5]Balokova,h&Starek.M.,J.BiolStand,1979.7:275-284.

[6]Dvorakova.M&Starek.M.,J.BiolStand,1980.8:107-113.

[7]中國生物學(xué)制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會.中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2000.56－5765.

[8]姜述德.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1985.7（2）：80.

[9]章靜波.組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).人民衛(wèi)生出版社，2002.

[10]鄂征.組織培養(yǎng)技術(shù).人民衛(wèi)生出版社，1995.