郭文博等

摘 要 為摸清復雜基質中FB1和FB2污染的準確水平，本研究建立了高效液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS）測定不同畜禽配合飼料中伏馬毒素B1（FB1）和B2（FB2）的分析方法。樣品用乙腈水（50∶50， V/V）提取，MAX強陰離子固相萃取柱富集凈化后，以0.1%甲酸和甲醇為流動相，經Thermo C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 5 μm）分離，采用電噴霧正電離（ESI+）多反應模式（MRM）監(jiān)測，外標法定量。結果表明：不同飼料樣品中FB1和FB2在1～500 μg/kg之間線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.9990，定量限分別為0.098和0.197 μg/kg，檢出限分別為0.328和0.656 μg/kg； 低、中、高濃度加標回收率為89.7%～95.1%，相對標準偏差（RSD）為3.2%～8.6%。用本方法對市場上采集的106份不同畜禽配合飼料中FB1和FB2含量進行測定，樣品檢出率為98.11%。本方法適用于基質復雜的畜禽配合飼料中伏馬毒素FB1和FB2的準確、快速定性與定量分析。

關鍵詞 伏馬毒素； 陰離子固相萃取柱； 液相色譜串聯質譜法； 畜禽配合飼料

1 引 言

伏馬毒素是20世紀80年代末發(fā)現，由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）在一定溫度和濕度條件下產生的，以污染玉米及其制品為主的水溶性次級代謝產物[1]，由多氫醇與丙三羧酸組成的雙酯類化合物，與人或動物機體內神經鞘氨醇結構極為相似，在神經鞘脂代謝過程中能競爭性地結合神經鞘氨醇N2?；D移酶，從而抑制神經鞘氨醇的生物合成、阻礙鞘脂類代謝，引發(fā)各種疾病[2]。研究證實，伏馬毒素能引起馬大腦白質軟化癥（Equine leucoencephalomalacia，ELEM），豬肺水腫綜合征（Porcine pulmonary edema，PPE）； 小鼠實驗也表明， 伏馬毒素對肝臟或腎臟容易造成損傷[3，4]。此外，伏馬毒素還具有很強的細胞毒性及免疫毒性，與人類食道癌的發(fā)生密切相關[5]。因此，國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）將伏馬毒素列為2B級致癌物作為人類潛在的致癌物質。

伏馬毒素主要分布在玉米及玉米制品中，嚴重威脅畜禽及人類健康[6]。玉米作為畜禽配合飼料的最主要原料，是畜牧業(yè)賴以發(fā)展的重要基礎。因此，伏馬毒素含量水平的準確檢測對于畜禽配合飼料中伏馬毒素的防控和預警具有重要意義。目前，關于飼料中伏馬毒素的檢測方法主要有柱前衍生高效液相色譜法[7，8]、氣相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、酶聯免疫法[11]等，這些方法前處理復雜且靈敏度較低，不能滿足快速痕量檢測的要求。我國國家標準中對于玉米及其制品中伏馬毒素的檢測主要采用高效液相色譜法和熒光光度法[12]，選用液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS）作為仲裁法[13]，也有采用LCMS/MS測定谷物中的伏馬毒素的報道[14，15]，但這些方法都存在前處理復雜、靈敏度低等問題。此外，畜禽配合飼料由玉米、小麥、麩皮、棉粕、豆粕等多種原料混合而成，基質復雜多樣，容易產生基質效應，且不同動物飼料隨生理性影響組成各有差異，迫切需要一種能適應不同配合飼料基質、快速有效的檢測方法，以適應飼料行業(yè)監(jiān)督檢查和畜牧業(yè)生產的需求。在前人研究的基礎上，本研究采用MAX陰離子固相萃取柱富集凈化，改進流動相洗脫程序，縮短分析時間，有效消除基質效應，并用LCMS/MS進行分析，提高檢測靈敏度，可用于大批量畜禽配合飼料中FB1和FB2檢測分析，為不同畜禽配合飼料中伏馬毒素的準確定量分析提供技術支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜串聯質譜：TSQ Quant配Surveyor 液相操作系統(tǒng)（美國Thermo Fisher scientific公司）； MAX柱（200 mg，6 mL，美國Waters 公司）。Heraeus Multifuge X3高速離心機（Thermo Fisher Scientific中國有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）； 甲酸、乙酸（色譜純，美國Aladdin公司）； FB1、FB2標準品（德國Sigma公司）； 實驗用水由Millopore Synergy超純水儀（美國Millipore公司）制備。

2.2 實驗方法

2.2.1 液相色譜條件 Thermo C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）； 流動相A為0.1%甲酸； 流動相B為甲醇； 梯度洗脫： 0～1.0 mim，50% B； 1.0～7.0 min，50%～100% B； 7.0～8.0 min，100% B； 8.0～8.2 min，100%～50% B； 8.2～9.0 min，50% B。流速為300 μL/min； 進樣量5 μL； 柱溫30 ℃。

2.2.2 質譜條件 范圍m/z 300～800；碎裂電壓為1.5 V； 噴霧電壓為3.5 kV； 霧化氣壓采用電噴霧ESI（+）離子源，多反應監(jiān)測模式（MRM）采集；掃描力3500 Pa； 毛細管溫度為350 ℃； 鞘氣壓45 Pa； 輔助氣壓15 Pa。質譜檢測FB1和FB2的參數見表1。

2.2.3 樣品提取凈化 將飼料樣品充分粉碎，使其可通過1 mm孔徑網篩。準確稱取1.0 g±0.01 g飼料樣品于10 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈水（50∶50， V/V）提取劑[16，17]，渦旋混合1 min，超聲1 h，4500 r/min離心10 min。MAX柱依次用5 mL甲醇和5 mL甲醇水（3∶1， V/V）活化，然后加入2 mL上清液，再依次加入5 mL甲醇水（3∶1， V/V）和5 mL甲醇淋洗MAX小柱，最后用10 mL甲醇乙酸（99∶1， V/V）洗脫，收集洗脫液，在45 ℃氮氣吹干，殘渣用乙腈水（50∶50， V/V）定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后待測。endprint

3 結果與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 流動相組分的選擇

由于伏馬毒素在ESI（+）條件下產生的是[M+H]+離子，而酸性溶液有助于其離子化[18]，所以本實驗選擇在弱洗脫溶液中添加易揮發(fā)的甲酸，提高伏馬毒素離子化效率。本實驗以0.1%甲酸和甲醇為流動相，與0.05%， 0.2%， 0.5%甲酸和甲醇相比，兩種伏馬毒素的分離度好，峰形對稱且靈敏度高，如圖1。因此，本實驗最終選擇0.1%甲酸和甲醇為流動相。

3.1.2 起始流動相比例的選擇 分別以0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V） 和（50∶50， V/V）作為初始流動相，結果表明：初始流動相為0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V）時，峰形較寬，出峰時間晚，靈敏度較低； 初始流動相為0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）時，FB1與的FB2分離度好，出峰時間適中，峰形對稱，靈敏度高。因此，選擇0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）作為梯度洗脫的起始流動相。

3.2 不同凈化柱的選擇

3.4 方法的回收率和精密度

準確稱取1.00 g粉碎后的飼料樣品，加入適量的FB1和FB2混合標準溶液，使得飼料基質中FB1、FB2的含量分別為50， 100和200 μg/kg，每個水平做5個平行，按上述條件進行處理和測定，計算回收率。FB1、FB2在不同添加水平的回收率見表3，FB1、FB2在飼料基質中3個加標水平的回收率為89.7%～95.1%，符合國際上對玉米及飼料樣品中伏馬毒素污染殘留檢測的要求。

3.5 樣品分析

采用方法對上海及周邊城市隨機采集的不同品牌7類106個畜禽配合飼料樣品中的FB1、FB2含量進行測定，結果如圖3。伏馬毒素檢出率為98.11%，在所有檢測樣品中，FB1總含量在0～1 mg/kg之間有66個，占62.26%； 含量在1 mg/kg 以上的有40個，占37.74%，最高含量達20.1 mg/kg； FB2含量基本在0～1 mg/kg。因此，本方法適合不同種類畜禽配合飼料中FB1、FB2樣品的檢測。

4 結 論

本實驗用乙腈水（50∶50， V/V）作為提取劑，離心后，經MAX凈化柱富集凈化，以0.1%甲酸和甲醇為流動相分離，高效液相色譜串聯質譜法對不同畜禽配合飼料樣品中的FB1和FB2含量進行檢測。結果表明，本方法前處理簡單、重復性好、回收率和靈敏度高，適用于畜禽配合飼料中伏馬毒素的準確定量，為動物飼料中伏馬毒素的風險評估奠定基礎。

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Abstract A method was developed for the determination of fumonisin B1 （FB1） and fumonisin B2 （FB2） in livestock and poultry formula feeds by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS. After extracted by acetonitrilewater （50∶50， V/V） and purified with MAX solid phase extraction column， the fumonisins were separated by Thermo C18 （100 mm×2.1 mm， 5 μm） column with 0.1% formic acid in water and methanol as the mobile phase. Multiple reaction monitoring （MRM） was used to acquire mass spectrometric data under electrospray positive ionization mode （ESI+）. The results showed that the linear correlation coefficients （R2） of fumonisin FB1 and FB2 were all greater than 0.999 in the range of 1-500 μg/L. The limits of quantitation （LOQ） were 0.098 and 0.197 μg/L， and the limits of detection （LOD） were 0.328 and 0.656 μg/L， respectively. At different spiked levels， the recoveries of FB1 and FB2 were ranged from 89.7% to 95.1%， and the relative standard deviation （RSD） was ranged from 3.2% to 8.6%. Additionally， the detection rate reached 98.11% screening through the established method in the 106 livestock and poultry formula feeds collected from markets. This result indicates that the method is suitable for accurate quantitative analysis of FB1 and FB2 in different complicated livestock and poultry formula feeds.

Keywords Fumonisins； Anion exchange solid phase extraction column； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Livestock and poultry formula feeds

（Received 9 September 2014； accepted 5 January 2015）

This work was supported by the Key Project of Developing Agriculture through Science and Technology of Shanghai Municipal Agricultural Commission （No. 38 （2013）， 32 （2014））endprint