虞鳳慧，馬韻升，劉圣鵬，徐澤平，3 *，李 鋒，劉結(jié)磊

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500；3.濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心，山東 濱州 256500）

脂肪酶（1ipase，EC3.1.1.3）全稱即三?；视王；饷?，能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換[1-3]、多肽等有機(jī)合成反應(yīng)[4]，是目前被重點(diǎn)研究的酶催化劑[5-6]。隨著研究的逐漸深入，脂肪酶的生產(chǎn)技術(shù)日趨成熟，應(yīng)用越來越廣，但游離脂肪酶存在易失活、不易回收[7]、難重復(fù)使用等問題[8]。因此，在有機(jī)反應(yīng)體系中，游離脂肪酶作為催化劑難以大規(guī)模應(yīng)用。而固定化酶可解決以上問題，與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)[9-10]，又呈現(xiàn)操作穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控和工藝簡便等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。近年來，脂肪酶固定化的研究日益增加，并廣泛應(yīng)用于食品、洗滌劑、油脂和制藥等領(lǐng)域，在生物柴油制備方面也有重要應(yīng)用[14]。

脂肪酶固定化的方法主要有包埋法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法等[14-17]。包埋法具有不改變酶的結(jié)構(gòu)、酶活收率高等優(yōu)點(diǎn)，且包埋常用載體-海藻酸鈉，因其價(jià)格低廉、具有良好的生物相溶性而受到廣泛重視[11]。目前，海藻酸鈉單獨(dú)作為固定化載體的研究較多，而海藻酸鈉與羧甲基纖維素鈉共同作為載體的報(bào)道還不多見。本研究擬采用包埋法、以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合載體進(jìn)行脂肪酶的固定化，通過單因素及正交試驗(yàn)篩選最優(yōu)的固定化條件，期望為固定化脂肪酶的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶為畢赤酵母產(chǎn)高溫堿性脂肪酶（70 kU/mL）：實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇城東光芒儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶的固定化

分別稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉，用蒸餾水加熱溶解，配成一定含量的混合溶液，冷卻后加入一定量的脂肪酶粗酶液，使總酶活為200 U，攪拌、混勻、靜置。用注射器將無氣泡的混合溶液逐滴加入0.1 mol/L CaCl2溶液中，固化30 min。紗布過濾，用蒸餾水洗凈固定化顆粒，濾紙吸干水分，測定固定化酶酶活，計(jì)算酶活收率。

1.3.2 脂肪酶固定化條件的優(yōu)化

分別考察不同固定化載體、載體含量、加酶量、CaCl2濃度及固定化時(shí)間對(duì)脂肪酶固定化的影響，以固定化酶酶活收率為指標(biāo)，篩選各個(gè)單因素試驗(yàn)的最佳條件。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響脂肪酶固定化的主要因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，以固定化酶酶活收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最優(yōu)的固定化條件。

1.3.3 酶活力及酶活收率的測定

游離脂肪酶酶活力測定：參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中指示劑滴定法。酶活定義：1 mL液體酶（或1 g固體酶粉），在40 ℃溫度和pH 7.5條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL（U/g）表示。

固定化脂肪酶酶活力測定：按照游離脂肪酶酶活力測定方法。酶活收率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體對(duì)脂肪酶固定化的影響

分別選擇海藻酸鈉、海藻酸鈉-明膠（3∶1）、海藻酸鈉-PEG600（3∶1）、海藻酸鈉-聚乙烯醇（3∶1）、海藻酸鈉-羧甲基纖維素鈉（3∶1）為包埋載體，進(jìn)行脂肪酶的固定化，載體終含量為1.5%，結(jié)果見圖1。由圖1可知，以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合載體時(shí)，脂肪酶的固定化效果最好，固定化酶酶活收率最高，為34.20%。因此，選擇海藻酸鈉-羧甲基纖維素鈉復(fù)合載體進(jìn)行后續(xù)脂肪酶固定化研究。

2.2 海藻酸鈉含量對(duì)脂肪酶固定化的影響

海藻酸鈉含量過大或者過小，都會(huì)顯著影響酶的固定化效果。因此，固定羧甲基纖維素鈉的含量為0.4%，篩選出海藻酸鈉的最佳含量。分別設(shè)定海藻酸鈉含量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，進(jìn)行脂肪酶的固定化，結(jié)果見圖2。由圖2可知，海藻酸鈉含量為1.0%時(shí)，脂肪酶的固定化效果最好，固定化酶酶活收率為42.55%。因此，確定海藻酸鈉最佳含量為1.0%。

圖2 海藻酸鈉含量對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.2 Effect of sodium alginate content on lipase immobilization

2.3 羧甲基纖維素鈉含量對(duì)脂肪酶固定化的影響

固定海藻酸鈉含量為1.0%，分別設(shè)定羧甲基纖維素鈉含量為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，進(jìn)行脂肪酶的固定化，結(jié)果見圖3。由圖3可知，羧甲基纖維素鈉含量為0.4%時(shí)，固定化酶酶活收率為58.35%，因此，確定羧甲基纖維素鈉最佳含量為0.4%。

圖3 羧甲基纖維素鈉含量對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.3 Effect of carboxymethyl cellulose sodium content on lipase immobilization

2.4 加酶量對(duì)脂肪酶固定化的影響

固定上述最佳條件，分別設(shè)定脂肪酶添加量為50 U/（g載體）、100 U/（g載體）、150 U/（g載體）、200 U/（g載體）、400 U/（g載體）、800 U/（g載體），研究加酶量對(duì)脂肪酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，加酶量為100 U/（g載體）時(shí)，固定化酶酶活收率最高，隨著加酶量的逐漸增加，酶活回收率呈明顯的下降趨勢。因此，確定加酶量為100 U/（g載體）。

圖4 加酶量對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on lipase immobilization

2.5 CaCl2濃度對(duì)脂肪酶固定化的影響

固定上述最佳條件，分別設(shè)定CaCl2溶液濃度為0.1mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L，研究CaCl2溶液濃度對(duì)脂肪酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，CaCl2溶液濃度為0.2 mol/L時(shí)，固定化酶酶活收率最高。因此，確定CaCl2溶液最佳濃度為0.2 mol/L。

圖5 CaCl2濃度對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.5 Effect of CaCl2concentration on lipase immobilization

2.6 固定化時(shí)間對(duì)脂肪酶固定化的影響

圖6 固定化時(shí)間對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.6 Effect of immobilization time on lipase immobilization

固定上述最佳條件，分別設(shè)定固定化時(shí)間為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，研究固定化時(shí)間對(duì)脂肪酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著固定化時(shí)間的延長，固定化酶酶活收率呈先增加再減少后趨于穩(wěn)定的趨勢，30 min為最佳固定化時(shí)間。

2.7 脂肪酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以海藻酸鈉含量、羧甲基纖維素鈉含量、加酶量、CaCl2濃度和固定化時(shí)間為5個(gè)影響因素，以固定化酶酶活收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 脂肪酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for lipase immobilization conditions optimization

表2 脂肪酶固定化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for lipase immobilization conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響固定化酶酶活收率的因素主次關(guān)系為RC＞RA＞RE＞RD＞RB，即酶與載體配比＞海藻酸鈉含量＞固定化時(shí)間＞CaCl2濃度＞羧甲基纖維素鈉含量。最佳組合為A2B2C1D4E3，即脂肪酶的最優(yōu)固定化條件為海藻酸鈉含量1.0%、羧甲基纖維素鈉含量0.25%、加酶量50 U/g載體、CaCl2濃度0.4 mol/L，固定化時(shí)間40 min。并在此最優(yōu)固定化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到固定化脂肪酶酶活收率達(dá)99.50%。由表3可知，加酶量對(duì)固定化酶酶活收率有顯著影響，海藻酸鈉含量、羧甲基纖維素鈉含量、CaCl2濃度和固定化時(shí)間對(duì)固定化酶酶活收率影響均不顯著。

3 結(jié)論

本研究采用包埋法進(jìn)行了脂肪酶的固定化研究。以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合載體，通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)固定化條件為海藻酸鈉濃度為1.0%、羧甲基纖維素鈉濃度為0.25%、加酶量為50 U/（g載體）、CaCl2濃度為0.4 mol/L，固定化時(shí)間40 min。期望為固定化脂肪酶的研究及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

[1]金紅娣，王巧映，余 凱，等.海藻酸鈉固定化脂肪酶的制備及性質(zhì)研究[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2012（14）：142.

[2]KLIBANOV A M.Improving enzymes by using them in organic solvents[J].Nature,2001,409(11):241-246.

[3]SHARMA D,SHARMA B,SHUKLA A K.Biotechnological approach of microbial lipase:a review[J].Biotechnology,2011,10(1):23-40.

[4]何 茹，劉 婭，謝曉霞，等.內(nèi)生黑曲霉產(chǎn)脂肪酶條件研究及其粗酶酶學(xué)特性[J].中國釀造，2014，33（3）：52-56.

[5]馮 超，蔣麗娟，黎繼烈，等.固定化脂肪酶研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（2）：373-375.

[6]劉新喜.脂肪酶固定化方法的研究進(jìn)展[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，25（3）：370-373.

[7]李 陽，韋 偉，曹 茜，等.脂肪酶固定化新材料[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2014，29（7）：122-127.

[8]REN Y H,RIVERA J G,HE L H,et al.Facile,high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating[J].BMC Biotechnol,2011(11):63-71.

[9]張 斌，金 莉.固定化酶及其在食品中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑，2006（1）：147-150.

[10]劉海洲，張媛媛，張廣柱.固定化酶制備技術(shù)的研究進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2009，30（1）：21-23.

[11]于殿宇，羅淑年，王 瑾，等.海藻酸鈉-明膠固定化磷脂酶的研究[J].食品工業(yè)，2008（3）：9-10.

[12]韓志萍，葉劍芝，羅榮瓊.固定化酶的方法及其在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].保鮮與加工，2012，12（5）：48-53.

[13]陳冬梅.固定化酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：330-332.

[14]劉志勤，宋 笛.脂肪酶固定化及固定化脂肪酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2012（5）：89-92.

[15]魯玉俠，蔡妙顏，郭祀遠(yuǎn)，等.海藻酸鈉包埋法制備固定化脂肪酶研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（4）：30-32.

[16]王愛玲，楊江科，黃 瑛，等.海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化黑曲霉脂肪酶[J].應(yīng)用化工，2007，36（4）：317-320.

[17]MENDES A A,FREITAS L,DE CARVALHO A K,et al.Immobilization of a commercial lipase fromPenicillium camembertii(Lipase G) by different strategies[J].Enzyme Res,2011,doi:10.4061/2011/967239.