陳 佩，顏家保，余永登

（1. 武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081；2. 武漢科技大學(xué) 教務(wù)處，湖北 武漢 430081）

一株吡啶降解菌的篩選及其降解性能

陳 佩1，顏家保2，余永登1

（1. 武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081；2. 武漢科技大學(xué) 教務(wù)處，湖北 武漢 430081）

以吡啶為唯一碳源，從焦化廠活性污泥中分離得到一株對(duì)吡啶具有高效降解能力的菌株B1，對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了菌株B1適宜的降解條件，對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)擬合，并考察了菌株B1對(duì)焦化廢水中吡啶的降解效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：菌株B1為革蘭氏陰性菌，屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）；菌株B1適宜的降解條件為降解溫度30 ℃、初始pH 為7、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min；菌株B1對(duì)吡啶的降解過(guò)程符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，當(dāng)初始吡啶質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，降解速率常數(shù)最高達(dá)到21.103 mg/（L·h）；用菌株B1對(duì)初始吡啶質(zhì)量濃度為430 mg/L的實(shí)際焦化廢水處理74 h后，吡啶降解率可達(dá)74.26%。

吡啶降解菌；菌種篩選；活性污泥；焦化廢水；動(dòng)力學(xué)

吡啶是一種典型的含氮雜環(huán)化合物，普遍存在于焦化、煉油、皮革和制藥等行業(yè)的廢水中［1］。吡啶對(duì)環(huán)境的危害較大，并能影響人體的肝、腎功能，麻痹中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甚至致癌［2］。由于吡啶的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此廢水中的吡啶很難用傳統(tǒng)的生物處理法去除［3］。采用生物強(qiáng)化技術(shù)，向生物處理系統(tǒng)中投加吡啶的高效降解菌，可提高吡啶的去除效果［4-5］。國(guó)內(nèi)外分離出的能降解氮雜環(huán)化合物的微生物主要有：芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［6］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［7］和副球菌屬（Paracoccussp.）［8］等。

本工作從焦化廠活性污泥中篩選得到一株以吡啶為唯一碳源的高效降解菌，對(duì)該菌進(jìn)行了生理生化和16S rDNA鑒定，并就其降解特性和降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，為吡啶的生物強(qiáng)化處理提供了基本理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

活性污泥：取自武漢平煤武鋼聯(lián)合焦化有限責(zé)任公司污水廠曝氣池。

焦化廢水：取自武鋼聯(lián)合焦化有限責(zé)任公司污水廠曝氣池進(jìn)水，COD約為4 800 mg/L，ρ（NH3-N）約為200 mg/L，pH為6.5。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母提取物5. 0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH約為7.2。

吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NH4Cl 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g， CaCl20.02 g， NaCl 0.1 g，微量元素儲(chǔ)備液2 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，pH約為7。120 ℃、0.10～0.15 MPa高壓滅菌后，加入一定量的吡啶作為唯一碳源。

平板培養(yǎng)基：在吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～2.0%的瓊脂。

Mastercycle Gradient型PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Eppendorf公司；1100 C型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.2 菌株篩選

取2 mL活性污泥加入到已滅菌的100 mL LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)24 h。取2 mL富集后的菌液依次轉(zhuǎn)接到100 mL 質(zhì)量濃度為100，200，300，400，500，600 mg/L的吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10～12 h，以此來(lái)馴化吡啶降解菌。采用稀釋平板涂布法分離單菌落，再用劃線法分離純化2～3次。最后，將純化得到的菌株分別用600 mg/L的吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)各菌株對(duì)底物的降解能力，將降解能力最好的一株單菌選定為優(yōu)勢(shì)菌。

1.3 菌種鑒定

將優(yōu)勢(shì)菌的培養(yǎng)液稀釋涂布到平板培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形貌。按照文獻(xiàn)［9］報(bào)道的方法進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。提取該菌株的DNA［10］，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，委托武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 優(yōu)勢(shì)菌的降解特性

將優(yōu)勢(shì)菌的新鮮菌液按2%（φ）的接種量接入100 mL質(zhì)量濃度為300 mg/L的吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，考察降解溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速等條件對(duì)吡啶降解率的影響。

1.5 優(yōu)勢(shì)菌的降解動(dòng)力學(xué)

將優(yōu)勢(shì)菌的新鮮菌液按3%（φ）的接種量接入不同濃度的吡啶-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在最優(yōu)條件下進(jìn)行降解反應(yīng)，間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中剩余吡啶的質(zhì)量濃度，并用反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的降解數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

1.6 實(shí)際廢水中吡啶的降解

將焦化廢水用蒸餾水稀釋至COD約為800 mg/L，添加適量吡啶，使初始吡啶質(zhì)量濃度為430 mg/L。分別按以下4種方式加入優(yōu)勢(shì)菌：1）不加菌液和活性污泥（空白）；2）3 mL菌液；3）3 mL活性污泥；4）3 mL菌液+3 mL活性污泥。在30℃、150 r/min的條件下，考察優(yōu)勢(shì)菌對(duì)焦化廢水中吡啶的降解效果，以及菌種與污泥之間的相互作用。

1.7 分析方法

采用高效液相色譜法測(cè)定吡啶含量［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的篩選與鑒定

經(jīng)過(guò)分離純化，得到7株能降解吡啶的菌株，選取其中降解效果最好的一株B1作為優(yōu)勢(shì)菌，進(jìn)行菌種鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株B1為革蘭氏陰性菌，在LB培養(yǎng)基上菌落呈圓形，微凸，表面濕潤(rùn)光滑。對(duì)菌株B1進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，將測(cè)得的基因序列用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，序列相關(guān)性與菌株B1達(dá)到99%甚至更高的菌種都是不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.），因此可以推斷菌株B1在分子生物學(xué)上可以歸類于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）。菌株B1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

2.2 降解條件

2.2.1 降解溫度的影響

在初始pH 為7、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，降解溫度對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)：在降解反應(yīng)開(kāi)始的3 h內(nèi)，不同溫度下，吡啶的降解程度差別不大，可能原因是細(xì)菌在這段時(shí)間內(nèi)處于調(diào)整期，外界環(huán)境溫度的影響可以忽略不計(jì)；6 h后，菌株B1對(duì)吡啶的降解能力在不同溫度下存在明顯差異，25～30 ℃時(shí)，溫度越高，菌株B1對(duì)吡啶的降解效果越好；30～40 ℃時(shí)降解效果顯著下降，可能是由于溫度過(guò)高使得微生物體內(nèi)酶的活性受到抑制，阻礙了微生物的正常代謝；因此30℃是B1的最適宜降解溫度。

圖1 菌株B1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 降解溫度對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響

圖3 初始pH對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響

2.2.2 初始pH的影響

pH太小或太大都能使微生物酶的活性喪失，影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng)代謝。在降解溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，初始pH對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)：初始pH為3和5時(shí)，吡啶的降解程度很低，說(shuō)明菌株B1在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)受到了抑制；當(dāng)初始pH為7～10時(shí)，反應(yīng)18 h后，吡啶幾乎被完全降解，說(shuō)明菌株B1對(duì)pH的適應(yīng)力較強(qiáng)，在中性或堿性環(huán)境下都能存活，可能是因?yàn)檫拎ぴ诮到膺^(guò)程中，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生了戊二酸，酸性物質(zhì)中和了堿性條件下的堿性物質(zhì)。因此，菌株B1降解的最適初始pH為7。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速的影響

在降解溫度30 ℃、初始pH為7的條件下，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)剩余吡啶質(zhì)量濃度的影響

由圖4可見(jiàn)：隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)，不同搖床轉(zhuǎn)速時(shí)吡啶的降解效果慢慢顯露出差異；轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低都會(huì)有礙吡啶的降解效果，轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)，培養(yǎng)基中的溶解氧濃度降低，細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝放緩；搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min和200 r/min時(shí)，吡啶的降解曲線基本重合，且吡啶質(zhì)量濃度較低，這是因?yàn)閾u床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，培養(yǎng)基中的溶解氧基本達(dá)到飽和，再進(jìn)一步增加搖床轉(zhuǎn)速也不能提高溶解氧。綜合考慮，選取150 r/min為最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.3 菌株B1的降解動(dòng)力學(xué)

不同初始質(zhì)量濃度下吡啶的降解效果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，剩余吡啶質(zhì)量濃度（ρ）與降解時(shí)間（t）的關(guān)系曲線近似為直線，說(shuō)明菌株B1對(duì)吡啶的降解符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。擬合得到的菌株B1降解吡啶的零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：各初始吡啶質(zhì)量濃度下得到的直線方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9；初始吡啶質(zhì)量濃度為50～300 mg/L時(shí)，隨初始吡啶質(zhì)量濃度的增加，菌株B1對(duì)吡啶的降解速率常數(shù)逐步增大；當(dāng)初始吡啶質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，降解速率常數(shù)最大，達(dá)21.103 mg/（L·h）；當(dāng)初始吡啶質(zhì)量濃度大于400 mg/L時(shí)，隨初始吡啶質(zhì)量濃度的增加，降解速率常數(shù)反而降低，這可能是因?yàn)榈孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，底物毒性超出了菌體承受能力范圍，阻礙了菌體對(duì)底物的降解。

圖5 不同初始質(zhì)量濃度下吡啶的降解效果

表1 菌株B1降解吡啶的零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程

2.4 對(duì)焦化廢水中吡啶的降解

菌株B1對(duì)焦化廢水的處理效果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，在反應(yīng)開(kāi)始約30 h內(nèi)，4種加菌方式的吡啶降解效果均不好，原因可能是焦化廢水中污染物成分多、毒性較大，菌種適應(yīng)期較長(zhǎng)；在隨后的40～54 h內(nèi)，各加菌方式的降解效果逐漸拉開(kāi)差距，以加菌方式4）的吡啶降解效果最好，在降解時(shí)間為54 h時(shí)剩余吡啶質(zhì)量濃度即達(dá)到119.53 mg/ L。這是因?yàn)椋闎1適應(yīng)了環(huán)境，且菌株B1和活性污泥中的微生物可能經(jīng)過(guò)協(xié)同效應(yīng)共同代謝底物，加快了吡啶的降解。在降解時(shí)間為54～74 h時(shí)，加菌方式4）對(duì)吡啶幾乎沒(méi)有降解，這可能是因?yàn)樵诰闎1和活性污泥中含有的其他菌種的協(xié)同作用下，廢水中的有機(jī)物被大量去除，造成微生物碳源不足，使得吡啶降解率沒(méi)有持續(xù)增大。在降解時(shí)間為74 h時(shí)，加菌方式2）與4）的剩余吡啶質(zhì)量濃度相同，達(dá)到110.7 mg/L，吡啶降解率為74.26%，說(shuō)明菌株B1在單菌作用時(shí)即對(duì)吡啶有較好的降解效果。

圖6 菌株B1對(duì)焦化廢水的處理效果

3 結(jié)論

a）以吡啶作為唯一碳源，從焦化廢水活性污泥中分離篩選得到一株吡啶降解優(yōu)勢(shì)菌B1，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及16S rDNA測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果，鑒定菌株B1為革蘭氏陰性不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）細(xì)菌。

b）通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到菌株B1的最佳降解條件：降解溫度30 ℃，初始pH 為7，搖床轉(zhuǎn)速150 r/ min。

c）菌株B1對(duì)吡啶的降解符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。當(dāng)初始吡啶質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，菌株B1對(duì)吡啶的降解速率常數(shù)最大，達(dá)21.103 mg/（L·h）。

d）菌株B1能在初始吡啶質(zhì)量濃度為430 mg/L的實(shí)際焦化廢水中良好生長(zhǎng)，反應(yīng)74 h后的吡啶降解率達(dá)74.26%。

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（編輯 葉晶菁）

采用溶劑提取工藝將難處理煉油污泥變廢為寶

Chem Eng，2015，122（7）：7

一項(xiàng)采用低沸點(diǎn)溶劑萃取工藝的工業(yè)化項(xiàng)目已經(jīng)開(kāi)始施工，用于回收煉油廠流化催化裂化單元（FCCUs）產(chǎn)生的廢催化劑粉末和難處理污泥中的淤漿油。

據(jù)開(kāi)發(fā)商Cat精細(xì)化管理技術(shù)有限責(zé)任公司（CFMT）稱，該工藝可使煉油廠從本將被浪費(fèi)掉的廢物中分離出兩種有價(jià)物質(zhì): 可用作FCCUs平衡催化劑的粉末催化劑材料，以及可用作生產(chǎn)碳黑和針狀焦的優(yōu)級(jí)原料的淤漿油。

當(dāng)催化劑粉末（細(xì)粉）通過(guò)FCCU旋風(fēng)分離器逸出并累積在淤漿油流中，形成一種被比喻為“在糖漿中的滑石粉”的污泥。該污泥被分類為環(huán)境保護(hù)局（EPA）的資源回收和保護(hù)法案（RCRA）列出的K-170危險(xiǎn)廢棄物，并導(dǎo)致了“業(yè)務(wù)中最艱難的油箱清洗工作”。

目前這種污泥材料的處理方法是將淤漿油存儲(chǔ)罐底油泥采用光循環(huán)油（LCO）工藝稀釋，然后離心分離混合物。這種方法有缺點(diǎn)，因?yàn)榛厥盏挠秃写罅抗腆w污染物，而目前的方法仍然會(huì)以反洗催化劑細(xì)粉的形式產(chǎn)生K-170廢棄物，它們必須通過(guò)包括焚燒、填埋和水泥窯等成本高昂的方法處理。

CFMT已開(kāi)發(fā)出一種可集成到淤漿油過(guò)濾系統(tǒng)中的工藝，可將該反洗物流處理成為可回收平衡催化劑（以干粉的形式），并100%回收與細(xì)粉混在一起的淤漿油。四部分的模塊化過(guò)程開(kāi)始于消解槽，溶劑摻混物與污泥物料在其中混合并攪拌。然后，溶解的淤漿油被傾析出而殘余物經(jīng)過(guò)濾分離出固體催化劑顆粒。將溶劑-濕催化劑進(jìn)行干燥，溶劑從油中蒸發(fā)出來(lái)，兩者都被回收。溶劑使該材料呈現(xiàn)為可過(guò)濾性而無(wú)需提高溫度，因而節(jié)約了能源。

一座5 t/d的原型示范裝置已經(jīng)開(kāi)始建設(shè)。該裝置位于德克薩斯州SanLeon基地，不久將用于處理K-170廢棄物。該裝置于2015年7月啟動(dòng)。

（以上由趙淑戰(zhàn)供稿）

Screening of a Pyridine-Degrading Strain and Its Biodegradation Capability

Chen Pei1，Yan Jiabao2，Yu Yongdeng1
（1. School of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China；2. Academic Administration Off ce，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

Using pyridine as sole carbon source，a high-efficient pyridine-degrading strain B1 was separated from activated sludge of coking wastewater，and was identified. The optimum degradation conditions were investigated by signal factor experiments. The reaction process was described by kinetics equations. And the degradation effect of pyridine in coking wastewater by strain B1 was examined. The experimental results show that：The strain B1 is gramnegative bacterium identif ed as gram-negativeAcinetobactersp.；The optimum degradation temperature，initial pH and stirring speed is 30 ℃，7 and 150 r/min respectively；The pyridine degradation process follows the zero-order kinetics model，and when the initial pyridine mass concentration is 300 mg/L，the degradation rate constant is up to 21.103 mg/（L·h）；After the actual coking wastewater with 430 mg/L of initial pyridine mass concentration has been treated for 74 h，the pyridine degradation rate can reach 74.26%.

pyridine；strain screening；degradation；coking wastewater；kinetics

X784

A

1006-1878（2015）06-0566-05

2015 - 07 - 16；

2015 - 07 - 30。

陳佩（1990—），女，湖北省仙桃市人，碩士生，電話 15907122564，電郵 504532896@qq.com。

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2011CDA054）；武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（JCX0006）；武漢科技大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310488009）。