吳文輝，李文兵，陳詠梅，胡昌江*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都 611930)

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粒度對(duì)附子近紅外定量模型準(zhǔn)確性的影響

吳文輝1，李文兵2，陳詠梅2，胡昌江1*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都 611930)

目的：觀察樣品粒度對(duì)附子近紅外(NIR)定量模型準(zhǔn)確性的影響。方法：采用近紅外(NIR)光譜分析技術(shù)建立附子雙酯型生物堿和單酯型生物堿含量測(cè)定模型，對(duì)同批次同產(chǎn)地不同粒度附子樣品生物堿含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與化學(xué)測(cè)量值(HPLC)進(jìn)行比較。結(jié)果：附子最粗粉與粗粉近紅外(NIR)預(yù)測(cè)值與化學(xué)測(cè)量值(HPLC)誤差較大，雙酯型生物堿含量分別為15.251 4%和8.716 9%，單酯型生物堿含量分別為32.614 8%和17.946 7%，中粉～極細(xì)粉接近化學(xué)測(cè)量值(HPLC)且相差分別在5%和10%以內(nèi)。結(jié)論：樣品粒度對(duì)附子近紅外(NIR)定量模型準(zhǔn)確性存在一定影響，粒度越大，預(yù)測(cè)值與化學(xué)測(cè)量值(HPLC)誤差越大，中粉～極細(xì)粉測(cè)定值較為穩(wěn)定，可作為樣品測(cè)定前處理標(biāo)準(zhǔn)。

附子；粒度；近紅外；模型

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.子根的加工品，為回陽救逆之要藥，具有補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效[1]。因其含有毒性較大的烏頭堿(aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)以及次烏頭堿(hypaconitine)，故《中國(guó)藥典》2010版附子項(xiàng)下對(duì)其雙酯型生物堿和單酯型生物堿含量分別進(jìn)行了上限與下限的規(guī)定，在確保其臨床療效的同時(shí)保證毒性較低[2]。因此，為避免臨床中毒現(xiàn)象的發(fā)生，附子毒性成分的檢測(cè)一直以來都備受關(guān)注。近年來，由于近紅外(NIR)光譜分析技術(shù)的快速發(fā)展，為中藥的檢測(cè)提供了一種新型快速無污染的手段，特別是附子、川烏等有毒中藥毒性成分的定性定量[3-4]。然而，目前對(duì)于影響近紅外檢測(cè)結(jié)果的諸多因素，如樣本粒度等，卻研究較少[5]。本研究以附子為研究對(duì)象，重點(diǎn)觀察粒度對(duì)近紅外定量模型準(zhǔn)確度的影響，旨在為近紅外(NIR)快速測(cè)定的準(zhǔn)確性提供參考。

1 儀器與材料

美國(guó)Thermo antarisⅡ型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Electron)；JY20002型電子天平(感量0.01g，上海方瑞儀器有限公司)；BJA-500型高速多功能粉碎機(jī)(浙江愛雪廚房設(shè)備有限公司)；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

不同產(chǎn)地、批次附子由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡昌江教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品；新烏頭堿(批號(hào)：MUST-13012207)、次烏頭堿(批號(hào)：MUST-13011706)、烏頭堿(批號(hào)：MUST-13012802)、苯甲酰新烏頭原堿(批號(hào)：MUST-13032801)、苯甲酰烏頭原堿(批號(hào)：MUST-13052306)、苯甲酰次烏頭原堿(批號(hào)：MUST-13052301)。乙腈為美國(guó)Fisher色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取不同產(chǎn)地、批次附子樣品，粉碎成中粉。每批次樣品取3份，每份15g，共計(jì)90份樣品，標(biāo)記為1～90號(hào)。另取同一產(chǎn)地、同一批次樣品，分別粉碎成最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉、極細(xì)粉，備用。

2.2 樣品化學(xué)方法含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2010年版附子項(xiàng)下“含量測(cè)定”方法進(jìn)

行雙酯型生物堿和單酯型生物堿含量測(cè)定[2]。

2.3 NIR光譜采集

將每份樣品裝入旋轉(zhuǎn)石英杯中，搖勻，采用積分球漫反射測(cè)樣，掃描波長(zhǎng)范圍為10 000～4 000cm-1，分辨率為8cm-1，掃描次數(shù)為64 次，溫度為20℃，相對(duì)濕度為30%～50%。每個(gè)樣品掃描3 次，計(jì)算平均光譜[6]。結(jié)果見圖1。

圖1 附子NIR光譜疊加

2.4 近紅外定量測(cè)定模型建立

2.4.1 問題樣品處理 問題樣品是指NIR預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值間誤差較大，在相關(guān)圖上偏離對(duì)角線較遠(yuǎn)的樣品。將出現(xiàn)問題的樣品的Usage信息設(shè)為Ignore，結(jié)果見圖2。

圖2 附子樣品馬氏距離分布情況

2.4.2 主因子數(shù)選擇 近紅外定量模型建立過程中，主因子數(shù)是判斷模型代表性的主要因素之一，因此在建立模型前，首先對(duì)最佳主因子數(shù)進(jìn)行選擇。由圖3可知，雙酯型生物堿最佳主因子數(shù)為10，單酯型生物堿主因子數(shù)為5。

2.4.3 光譜預(yù)處理方法選擇 對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理可起到一定的放大和分離重疊信息的作用，可增加模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，見表1、表2。

圖3 附子近紅外定含量測(cè)定主因子數(shù)曲線

方案光譜預(yù)處理方法波長(zhǎng)范圍(cm?1)校正集RRMSECV驗(yàn)證集RRMSECV1Spectrum(原始光譜)+MSC(多元信號(hào)修正)5407．42～5295．574736．31～4366．054308．19～4111．490．81870．00850．6650．01082Firstderivstive(一階導(dǎo)數(shù)光譜)+Norrisderivative+MSC(多元信號(hào)修正)4308．19～4111．494736．31～4366．055407．42～5295．570．97070．00360．86540．00723Firstderivstive(一階導(dǎo)數(shù)光譜)+savitzky-golay+MSC(多元信號(hào)修正)4736．31～4643．757208．61～7096．767220．18～7212．470．67600．01090．51680．01314Secondderivstive(二階導(dǎo)數(shù)光譜)+Norris-derivative+MSC(多元信號(hào)修正)4265．77～4134．635218．43～4701．605480．70～5249．290．66260．01100．50640．01355Secondderivstive(二階導(dǎo)數(shù)光譜圖)+savitzky-golay+MSC多元信號(hào)修正)4242．63～4223．344408．47～4300．489349．21～9175．640．36480．01370．06870．0162

表2 附子單酯型生物堿光譜預(yù)處理方法選擇

從表1、表2可以看出，在附子雙酯型生物堿模型中主因子數(shù)為10、附子單酯型生物堿主因子數(shù)為5的條件下：First derivstive(一階導(dǎo)數(shù)光譜)+MSC(多元信號(hào)修正)+Norris derivative光譜預(yù)處理方法可得到較大的校正集相關(guān)系數(shù)R(0.970 7、0.937 0)和較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差RMSECV (0.003 6、0.002 8)以及較大的驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)R(0.865 4、0.887 3)和較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差RMSEPV (0.007 2、0.002 9)，故選擇方案2為附子近紅外測(cè)定模型光譜預(yù)處理方法。

2.4.4 定量模型建立 將1～70號(hào)樣品光譜圖作為校正集，71～90號(hào)作為驗(yàn)證集進(jìn)行模型建立，運(yùn)用TQ 8.0 定量分析軟件PLS 建立定量分析模型，輸入與每張圖譜相對(duì)應(yīng)的HPLC含量測(cè)定數(shù)值，計(jì)算得出模型。

2.5 結(jié)果

2.5.1 NIR定量分析模型 所建立的2個(gè)模型中，雙酯型生物堿含量測(cè)定模型校正集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSECV)為0.003 6，相關(guān)系數(shù)(R)為0.970 7，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEPV)為0.007 2，相關(guān)系數(shù)(R)為0.8654；單酯型生物堿含量測(cè)定模型校正集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSECV)為0.002 8，相關(guān)系數(shù)(R)為0.937 0，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEPV)為0.002 9，相關(guān)系數(shù)(R)為0.887 3。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 附子原藥材雙酯型生物堿含量檢查模型譜

2.5.2 粒度對(duì)模型準(zhǔn)確性的影響 NIR光譜中除了包含樣品基質(zhì)的化學(xué)組成信息外，還包含有樣品的物理信息。如顆粒尺寸的不同會(huì)產(chǎn)生基線偏移；顆粒尺寸越粗糙，光線的穿透力越強(qiáng)，吸收越強(qiáng)，但顆粒的尺寸對(duì)模型測(cè)定準(zhǔn)確的影響卻沒有明確定論。本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2010年版凡例中對(duì)粉末的要求進(jìn)行樣品制備，觀察粒度對(duì)附子生物堿近紅外模型準(zhǔn)確度的影響，結(jié)果見表3、表4。

圖5 附子原藥材單酯型生物堿含量測(cè)定模型譜

表3 雙酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果 (%)

表4 單酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果 (%)

注：誤差=(HPLC值-NIR值)/HPLC值×100。

由表3、表4可看出，樣品的粒度越小，近紅外測(cè)定值與化學(xué)測(cè)定方法(HPLC)值越接近，樣品粒度越大則測(cè)定值誤差越大。兩個(gè)模型測(cè)定結(jié)果均顯示：樣品粒度在中粉～極細(xì)粉粒度范圍內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，且接近化學(xué)測(cè)定(HPLC)值。

3 討論

由圖4、圖5可看出，所建立的2個(gè)模型中，雙酯型生物堿含量測(cè)定模型校正集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSECV)為0.003 55，相關(guān)系數(shù)(R)為0.970 7，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEPV)為0.007 16，相關(guān)系數(shù)(R)為0.865 4；單酯型生物堿含量測(cè)定模型校正集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSECV)為0.002 80，相關(guān)系數(shù)(R)為0.937 0，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMSEPV)為0.002 91，相關(guān)系數(shù)(R)為0.887 3。各參數(shù)均較優(yōu)，模型可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未知樣品。由表3、表4可以看出，樣品粒度越大，預(yù)測(cè)值與化學(xué)值偏差越大，樣品粒度在中粉～極細(xì)粉粒度范圍內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，且接近化學(xué)測(cè)定(HPLC)值。

附子單酯型生物堿預(yù)測(cè)模型中，主因子數(shù)為5，低于最佳主因子數(shù)10，說明模型未能代表附子所有產(chǎn)地和批次，模型覆蓋面較窄，需在后期工作中補(bǔ)充樣本量以增加模型數(shù)據(jù)庫(kù)的全面性[7]。在表3與表4中，樣品粒度越大，則誤差越大，可能與樣品粒度越大，漫反射光越少，多數(shù)光為透射和折射有關(guān)[8]。雙酯型生物堿預(yù)測(cè)結(jié)果誤差值顯著小于單酯型生物堿預(yù)測(cè)誤差值，可能與單酯型生物堿含量較少、數(shù)值較小有關(guān)。近紅外光譜分析技術(shù)測(cè)定值本身與化學(xué)測(cè)定值存在一定誤差，故數(shù)值越小，誤差越大。

[1] 高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2002.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:177.

[3] 高榮強(qiáng),范世福.現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)的原理及應(yīng)用[J].分析儀器,2002(3):9-12.

[4] 全智慧.NIR分析技術(shù)在制川烏配方顆粒制備過程中的應(yīng)用研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[5] 杜敏.中藥近紅外光譜檢測(cè)影響因素的研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[6] 柳俊.近紅外光譜分析技術(shù)在白芍中藥配方顆粒制備過程中的應(yīng)用研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2011.

[7] 黃禮麗.近紅外光譜分析技術(shù)的應(yīng)用研究[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用,2013(24):19.

[8] 嚴(yán)衍祿.近紅外光譜分析基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Effect of particle size on the Accuracy of Near Infrared Quantitative Model ofAconitiLateralisPreparata

Wu Wenhui1,Li Wenbing2,Chen Yongmei2,Hu Changjiang1*

(1.Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China; 2.Neo-Green Pharmaceutical Co.Ltd.,Chengdu 611930,China)

Objective:To observe the effect of sample particle size on the accuracy of near infrared(NIR) quantitative model of Aconiti Lateralis Preparata. Methods:Determination of the content of technical analysis model of Aconiti Lateralis Preparata diester diterpenoid alkaloids and single ester type alkaloids by near infrared(NIR) spectroscopy with the same origin, the same batch of different particle size of Aconiti Lateralis Preparata root samples were predicted and chemical measurements (HPLC) were compared. Results:AconitiLateralisPreparata most coarse powder and coarse powder of near infrared(NIR) prediction value and chemical measurements (HPLC) error is large, double ester alkaloid non are 15.251 4% and 8.716 9%, single ester type alkaloids were 32.614 8% and 17.946 7%, fly to very fine powder close chemical measurements (HPLC) and the difference in 5% and 10% respectively in within the. Conclusion:The sample size has certain effects on the monkshood NIR quantitative model accuracy, the larger size, the predictive value and chemical measurements (HPLC) error is large, very fine powder in the powder to the determination of the value of relatively stable, can be used as determination standard sample pretreatment.

AconitiLateralisPreparata;Particle Size;Near Infrared;Model

2015-05-14

四川省科技創(chuàng)新苗子工程(No.2014-088)

吳文輝(1986-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥婆c臨床。

胡昌江(1952-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥婆c臨床。

R284.1

A

1673-2197(2015)20-0007-04

10.11954/ytctyy.201520004