向志蕓，李小芳，羅開(kāi)沛，羅 佳，林 浩，嚴(yán)敏嘉

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137)

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響應(yīng)面法優(yōu)化龍膽苦苷的純化工藝

向志蕓，李小芳*，羅開(kāi)沛，羅 佳，林 浩，嚴(yán)敏嘉

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137)

目的：應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)選龍膽苦苷的大孔樹(shù)脂純化工藝。方法：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素試驗(yàn)，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，采用三因素五水平響應(yīng)面分析方法，以龍膽苦苷的轉(zhuǎn)移率和龍膽苦苷的百分含量為考察指標(biāo)，對(duì)上柱液濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定龍膽苦苷的大孔樹(shù)脂純化工藝。結(jié)果：采用HPD-100型大孔樹(shù)脂，最佳純化工藝為：上柱液質(zhì)量濃度為0.2g/mL,乙醇濃度為30%，乙醇用量為5BV，龍膽苦苷的百分含量可達(dá)到73.4%。結(jié)論：星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化龍膽中龍膽苦苷的純化工藝效率高、方法簡(jiǎn)便、預(yù)測(cè)性好，可用于實(shí)驗(yàn)室小量制備，為擴(kuò)大再生產(chǎn)提供參考。

龍膽；龍膽苦苷；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；大孔樹(shù)脂；純化工藝

龍膽(Gentianachinensis)為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag)、龍膽(Gentian.ascabraBge.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall. )或滇龍膽(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根莖,前三種習(xí)稱“龍膽”，后一種習(xí)稱“堅(jiān)龍膽”，具有清熱、瀉肝、定驚之功效。據(jù)《現(xiàn)代本草綱目》[1]記載，因其葉如龍葵，味苦如膽，因此而得名。化學(xué)成分研究表明，龍膽苦苷(gentiopicroside，GTP)是龍膽科植物龍膽、秦艽等活性最強(qiáng)的有效成分之一[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，龍膽苦苷對(duì)多種肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛作用，具有非常重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值[3]。龍膽苦苷已獲得SFDA新藥證書。為更好地開(kāi)發(fā)利用它，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了龍膽苦苷的最佳純化工藝研究，以期使龍膽苦苷得到進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和有效利用。

1 儀器與試藥

UV-6100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，PS-60A型超聲波清洗器，BP-61 電子天平，Q-250B3型高速多功能粉碎機(jī),龍膽飲片購(gòu)于四川新荷花中藥飲片股份有限公司(批號(hào):1111044，產(chǎn)地:云南)，粉碎至粗粉，備用。龍膽苦苷對(duì)照品購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司(批號(hào):MUST-14081205)，D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300型大孔樹(shù)脂( 滄州寶恩吸附材料科技有限公司) ，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽上柱液的制備

準(zhǔn)確稱取龍膽藥材10g,60%乙醇加熱回流提取3次，第1次2h，第2次1h，第3次1h,溶劑用量為12倍。合并3次提取液，減壓回收溶劑，濃縮后離心，加入適量水，制得一定濃度的龍膽上柱液。

2.2 龍膽苦苷含量測(cè)定方法

2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別取不同濃度的對(duì)照品溶液和樣品溶液在200～800nm作紫外掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為274nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取0.003 28g溶液置25mL棕色容量瓶中，先用10mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容于至刻度，搖勻，即得。精密吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL于容量瓶中，得龍膽苦苷濃度為6.56g/mL、13.12g/mL、19.6g/mL、26.24g/mL、32.8g/mL、39.36g/mL的溶液，以70%乙醇稀釋至刻度，用紫外分光光度計(jì)在274nm處，以70%乙醇為隨行空白，測(cè)定吸光度，所得結(jié)果以龍膽苦苷溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作線性回歸，得回歸方程為A=0.019 2C+0.011 4，(r=0.999 1)，對(duì)照品濃度在13.12～39.36μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。實(shí)驗(yàn)所需進(jìn)行含量分析的樣品，均采用以上回歸方程進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得含量測(cè)定結(jié)果。

2.3 龍膽苦苷純化工藝優(yōu)選

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) ①靜態(tài)-吸附解析試驗(yàn)篩選樹(shù)脂型號(hào)。準(zhǔn)確稱取5種經(jīng)預(yù)處理的干樹(shù)脂(D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300)各4g于100mL具塞磨口錐形瓶中，分別加入20mL的龍膽上柱液(按龍膽藥材計(jì)為0.10g·mL-1)，放置24h并適當(dāng)振搖，濾過(guò)，取上清液測(cè)定龍膽苦苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的吸附量和吸附率。將已吸附飽和的不同樹(shù)脂置于100mL具塞磨口錐形瓶中，分別加20mL 30%乙醇振蕩24h進(jìn)行靜態(tài)洗脫，測(cè)定洗脫液中龍膽苦苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫率。以樹(shù)脂吸附量、吸附率和洗脫率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳樹(shù)脂。結(jié)果顯示，HPD-100型樹(shù)脂對(duì)龍膽苦苷的吸附-洗脫性能最佳。②上柱液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響。分別取10mL藥材質(zhì)量濃度為0.05g/mL,0.1g/mL,0.2g/mL,0.3g/mL,0.5g/mL的龍膽上柱液，上于15mL HPD-100大孔樹(shù)脂柱，以2BV/h的流速通過(guò)大孔樹(shù)脂，分別測(cè)定流出液中GTP的質(zhì)量濃度，并計(jì)算GTP的吸附量和吸附率。結(jié)果顯示，選擇上樣藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL較適宜。③HPD-100型樹(shù)脂對(duì)龍膽苦苷動(dòng)態(tài)吸附性能的考察。將藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL的上柱液加于裝有15mLHPD-100型樹(shù)脂的樹(shù)脂柱上，控制流速為2BV/h，每4mL收集一份流出液，測(cè)定各流出液中龍膽苦苷的質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線，橫坐標(biāo)為流出液體積(mL),縱坐標(biāo)為龍膽苦苷的吸附量(mg/mL)。結(jié)果顯示：15mL樹(shù)脂泄露前流出液的體積為4mL。此時(shí)樹(shù)脂床共吸附GTP 92mg，濕態(tài)HPD100樹(shù)脂對(duì)GTP的工作吸附量(泄漏前吸附量)可達(dá)6.13mg/mL。④上柱流速對(duì)吸附的影響。取10mL藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液4份，分別加于裝有15mL HPD-100型樹(shù)脂的樹(shù)脂柱上，上柱液分別以1BV/h、1.5BV/h、2BV/h、3BV/h的流速通過(guò)HPD-100樹(shù)脂柱，收集流出液，測(cè)定流出液中GTP濃度，計(jì)算吸附率。結(jié)果顯示：當(dāng)流速為3BV/h時(shí)，吸附率達(dá)到最高(96.3%)。⑤洗脫劑的確定。取10mL藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL龍膽上柱液5份，分別加于裝有15mL HPD-100型樹(shù)脂的樹(shù)脂柱上，控制上柱流速和洗脫流速均為3BV/h,待吸附完全后，用3BV的去離子水洗去樹(shù)脂表面或內(nèi)部殘留的多糖、無(wú)機(jī)鹽等水溶性雜質(zhì)，分別用4BV的10%、20%、30%、40%、50%的乙醇液進(jìn)行洗脫，測(cè)定各流出液中GTP的含量，計(jì)算洗脫率。結(jié)果顯示20%乙醇的洗脫率可達(dá)到80%，隨乙醇濃度增加，洗脫率在增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，洗脫率達(dá)到最大(85%)，故洗脫劑濃度在20%～40%均可。⑥洗脫劑用量考察。取10mL藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液上于HPD-100型樹(shù)脂柱，控制上柱流速為3BV/h,待吸附完全后，用3BV去離子水洗滌樹(shù)脂，用30%乙醇洗脫液洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，每1BV收集一份流出液，測(cè)定流出液中龍膽苦苷的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示：當(dāng)洗脫液體積達(dá)到5BV時(shí)，能基本洗脫完全，所以，初步確定洗脫液用量為5BV。⑦洗脫流速的確定。取10mL藥材質(zhì)量濃度為0.3g/mL的龍膽上柱液上于HPD-100型樹(shù)脂柱，流速為3BV/h，待吸附完全后，用3BV的蒸餾水洗脫，再用5BV 30%乙醇分別以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速進(jìn)行洗脫，測(cè)定30%乙醇洗脫液中GTP的質(zhì)量濃度，計(jì)算GTP的洗脫率。結(jié)果顯示：當(dāng)洗脫流速3BV/h時(shí)，洗脫率最高。

2.3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果 在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選擇對(duì)龍膽苦苷純化影響較大的三個(gè)因素即上柱液濃度、乙醇濃度、洗脫劑用量為考察因素，龍膽苦苷的轉(zhuǎn)移率(y1)和干膏中龍膽苦苷的百分含量(y2)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用三因素五水平分析方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。數(shù)據(jù)處理采用“歸一化法”，運(yùn)用Hassan[4]方法分別對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”(dmax)，計(jì)算公式為dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，然后計(jì)算“總評(píng)歸一值(OD)”，計(jì)算公式為OD=(d1·d2···dn)1/n(n為指標(biāo)數(shù))。

表1 因素水平

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

2.3.3 模型建立與回歸分析 以O(shè)D值為因變量，使用Design-expert8.0.5b軟件對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得多元線性回歸方程Y=-1.398 27+2.145a+0.018 6b+0.203 9c(r=0.604)，二項(xiàng)式擬合方程為Y=-12.065 7+10.309 8a+0.464 9b+1.632 0c-0.009 9ab+0.821 3ac-0.008 6bc-34.211 1a2-0.006 7b2-0.131 5c2(r=0.989)，線性回歸方程相關(guān)系數(shù)小，二項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)大，說(shuō)明二項(xiàng)式擬合方程擬合效果好，可信度高，可用于對(duì)龍膽苦苷的純化工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.3.4 工藝優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)回歸方程，作相應(yīng)曲面圖和等高線圖(圖1～圖3)，求導(dǎo)結(jié)果顯示，當(dāng)上柱液質(zhì)量濃度0.2g/mL，乙醇濃度為30.27%，乙醇用量為5.71BV時(shí)，OD值最大，龍膽苦苷的百分含量達(dá)到73.3%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況，確定優(yōu)化工藝為：上柱液質(zhì)量濃度0.2g/mL，乙醇濃度為30%，乙醇用量為5BV。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化后的最佳純化工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，3次驗(yàn)證試驗(yàn)純化產(chǎn)物中龍膽苦苷的百分含量的實(shí)測(cè)值為73.2%、72.9%、72.4%，與預(yù)測(cè)值偏差分別為1.20%、0.87%、1.03%，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好，二項(xiàng)式模型具有較高的可靠性。

3 討論

龍膽苦苷具有顯著的抗肝損傷、抗病毒、抗炎作用，具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化龍膽苦苷的大孔樹(shù)脂純化工藝，使干膏粉末中龍膽苦苷的百分含量最高達(dá)到73.2%，達(dá)到了提高有效成分相對(duì)含量的目的，可為減少以龍膽為主要成分的制劑的服用量提供參考，可為實(shí)驗(yàn)室小量制備龍膽苦苷或工業(yè)大生產(chǎn)提供參考。

圖1 上樣液的濃度(a)和洗脫劑的濃度(b)的相互作用對(duì)龍膽苦苷純化工藝影響的效應(yīng)面和等高線

圖2 上樣液的濃度(a)和洗脫劑用量(c)的相互作用對(duì)龍膽苦苷純化工藝影響的效應(yīng)面和等高線

圖3 洗脫劑的濃度(b)和洗脫劑用量(c)的相互作用對(duì)龍膽苦苷純化工藝影響的效應(yīng)面和等高線

[1] 黃泰康.現(xiàn)代本草綱目[M]. 北京：中囯醫(yī)藥科技出版社,2001.

[2] 楊書彬，王承. 龍膽化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，33(6):54-56.

[3] 劉占文，陳長(zhǎng)勛，金若敏，等. 龍膽苦苷的保肝作用研究[J].中草藥，2002，33(1):47-50.

[4] 吳偉，陸彬. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中多指標(biāo)的優(yōu)化: 星點(diǎn)設(shè)計(jì)和總評(píng)“歸一值”的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2000,35(8):530-533.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Purification Process for Gentiopicroside by Response Surface Method

Xiang Zhiyun，Li Xiaofang*，Luo Kaipei，Luo Jia，Yang Lu，Lin Hao,Yan Minjia

(Chengdu University of TCM；Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines；System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base，Chengdu 611137，China)

Objective:The response surface method preferred gentiopicroside macroporous resin purification process.Methods:Pre-test and single factor test，according to the design-response surface methodology design principles，using three factors and five levels of response surface analysis methods to transfer rate and the percentage of gentiopicroside gentiopicroside for inspection indicators of concentration on the column，eluent concentration，eluent usage optimization，and ultimately determine gentiopicroside macroporous resin purification process.Results:HPD-100 macroporous resin，optimum purification process: the concentration of the liquid column 0.2g/mL，the ethanol concentration of 30%，the amount of ethanol 5BV，gentiopicroside percentages reach 73.4%.Conclusion:design-response surface methodology to optimize high gentian gentiopicroside purification process efficiency，easy way to predict，and can be used to prepare a small laboratory and provide reference for the expanded reproduction.

Gentian;Gentiopicroside;Design-response Surface Methodology;Macroporous Resin;Purification Process

2015-04-14

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZA0094)

向志蕓(1990-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬图爸兴幮录夹g(shù)。E-mail：498939565@qq.com

李小芳(1964-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬图爸兴幮录夹g(shù)。E-mail：lixiaofang918@163.com

R284

A

1673-2197(2015)17-0016-04

10.11954/ytctyy.201517009