祖克拉·肉孜 宋曼殳 布帕提瑪穆·阿布都克熱穆 伊力哈木·乃扎木

多力坤·買買提玉素甫

摘 要：對過氧化物酶體增殖物激活受體基因（PPARG）的31個SNP位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，利用質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測PPA RG基因的31個SNPs位點(diǎn)多態(tài)性，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型，統(tǒng)計(jì)分析31個SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布頻率，利用x2檢驗(yàn)確定篩選的SNP位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)31個SNP位點(diǎn)中，23個位點(diǎn)的次等位基因分布頻率MAF≥0.05，在新疆維吾爾族人群中具有多態(tài)性，其他8個SNP位點(diǎn)的MAF< 0.05，沒顯示多態(tài)性?；蛐秃偷任换蝾l率在男女兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），表明這些位點(diǎn)等位基因分布不存在性別差異。

關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體（PPA RG）；SNP位點(diǎn)；維吾爾族人群

中圖分類號：Q39

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0189-07

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）是指人類基因組中單個堿基的變異，推測人類基因組至少有210萬個SNPs[1]。SNPs是人類種族差異、個體差異的分子基礎(chǔ)，成為第三代多態(tài)性標(biāo)記，是基因組多樣性和識別及定位疾病相關(guān)基因的一種新型手段[2]。SNPs數(shù)量大、分布廣，在人類30億堿基中有約3x106個SNPs位點(diǎn)，在任何已知或未知疾病基因附近都可能找到眾多的SNPs[1]。應(yīng)用高密度的SNPs圖譜，通過相關(guān)分析或連鎖分析可以定位一系列多基因疾病，如糖尿病、高血壓、哮喘、癌癥等的主基因。因此，人們希望通過研究SNP圖譜，更深刻地認(rèn)識癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等發(fā)病率高的多基因疾病的發(fā)生機(jī)制[2，3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體PPA RG基因定位于3p25，屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，主要表達(dá)于脂肪組織，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化過程，參與脂肪細(xì)胞的凋亡，PPA RG基因功能缺失突變可以導(dǎo)致脂肪萎縮，在脂肪細(xì)胞特異基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面發(fā)揮著重要作用[4]。PPA RG也可能成為肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化的新型治療靶點(diǎn)[5-9]。研究提示其可能在脂肪細(xì)胞分解、能量消耗及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4，10-14]。目前認(rèn)為PPA RG在人體能量代謝的調(diào)節(jié)控制中起核心作用，直接影響到葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)、葡萄糖胺生成速率和組織的糖異生能力，經(jīng)大樣本薈萃分析顯示單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與2型DM易感性相關(guān)[15-19]。

至今雖然在不同種族報(bào)道了PPARG基因多態(tài)性方面的很多關(guān)聯(lián)研究，但研究結(jié)果不一致，且研究位點(diǎn)多集中于少數(shù)幾個常見SNP有報(bào)道。為此，本研究探討新疆維吾爾族健康人群PPA RG基因的31個SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，為進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與相關(guān)疾病發(fā)病危險性和前瞻性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本

采自在新疆地區(qū)民豐縣縣醫(yī)院體檢的健康維族人群無關(guān)個體50例，要求所有調(diào)查對象均在所在地區(qū)居住3代以上，無血緣關(guān)系，年齡>40歲，家庭婚姻史為世代族內(nèi)通婚。自肘靜脈采血3 mL加0.5 mL ACD抗凝，充分混勻后放人-20°C冰箱冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑和儀器

基因擴(kuò)增：ABI Gene Amp@9700 384 Dual，質(zhì)譜點(diǎn)樣：Mass ARRAY Nan dispenser RS1000；質(zhì)譜分析：Mass ARRAY Compact System；試劑：Complete Genotyping Reagent Kit for Mass AR-RAY@ Compact 384。

1.3方法及步驟闡述

1）基因組DNA提取及DNA樣品濃度和純度質(zhì)檢：采用北京Transgenic Biotech有限公司的EasyPureTM Blood Genomic DNA Kit試劑盒。分離出的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)，并通過紫外分光光度計(jì)檢測OD260 /OD28080數(shù)值，調(diào)整DNA終濃度在30～50 ng/μL之間。 2）引物設(shè)計(jì)及引物稀釋：根據(jù)SNP位點(diǎn)通過美國Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；通過質(zhì)譜預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行延伸引物質(zhì)檢，將引物稀釋到質(zhì)譜反應(yīng)所需濃度。PCR引物儲備液制備：配置PCR引物儲備液，終濃度為100 μmol/L；單堿基延伸引物儲備液制備：配置單堿基引物儲備液，終濃度為500 μmol/L；引物設(shè)計(jì)詳細(xì)（見表2）。

3） PCR反應(yīng)：5μL的PCR反應(yīng)體系中含有ddH20 1.8 μL，10* buffer 0.5μL，Mg2+ 0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hot star 0.2μL，F(xiàn) Primer/R Primer 1μL，基因組DNA樣品（20—50 ng），至終體積5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，95 0C 30 s，56 0C 30 s，72 0C 60 s*45個循環(huán)；72 0C 5 min；25 aC∞。

4） SAP酶消化反應(yīng)：按照下述順序配制SAP酶Mix：總體積2x460，dddH20 1.53x460pLL，SAP Buffer 0.17x460 μL，SAP Enzyme 0.3x460μL，下一步在PCR儀中按照下述程序進(jìn)行SAP酶消化：37 0C 40 min，85 0C 5 min，25 0C ∞。

5）單堿基延伸反應(yīng)：按照下述順序配制單堿基延伸反應(yīng)Mix：三蒸水0.619x460 μL，lOx iplex buffer 0.2x460 μL，Terminator mix 0.2x460μL.引物0.94x460 μL，單堿基延伸酶0.041x460 μL，至終體積2x460 μ1。下一步在PCR儀中按照下述程序進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)：預(yù)變性94℃30 s，分別為94 °C 5 s，52℃Ss進(jìn)行40個外部循環(huán)，分別為80 °C 5 s，72 0C 3 min進(jìn)行40個內(nèi)部循環(huán)，25 °C ∞。

6）樹脂純化：將反應(yīng)產(chǎn)物的384孔板中加入16 μL三蒸水，在離心機(jī)中離心2 000轉(zhuǎn)離心3 min；加入樹脂，在反轉(zhuǎn)搖勻儀上做樹脂純化反應(yīng)35 min，脫鹽；反應(yīng)完成后在離心機(jī)中離心2 000轉(zhuǎn)離心3 min。將脫鹽處理后的樣品點(diǎn)在樣品靶上，自然結(jié)晶。

7）進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并收集數(shù)據(jù)：MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜）反應(yīng)；Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所有完成的問卷統(tǒng)一編碼，使用SPSS Data Entry 2.0軟件建立數(shù)據(jù)庫。所選SNP位點(diǎn)群體基因型經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用直接計(jì)數(shù)法對各個SNP位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群中的頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率分布特征的比較。

2 結(jié)果

1） SNP位點(diǎn)借于MAF值進(jìn)行Hardy -Wein-berg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。

一般以P=0.05作為顯著性水平的界值，P>0.05說明所調(diào)查的群體達(dá)到遺傳平衡，即本次群體調(diào)查的數(shù)據(jù)可信；SNP分子標(biāo)識的選擇依據(jù)：①最小等位基因頻率（MAF）≥0.05；②PPARG與多代謝異常有關(guān)的SNP；③所選的SNP位于基因片段功能區(qū)或可能改變功能的區(qū)域[19J。X2檢驗(yàn)中自由度的法則為：由于總的理論數(shù)必須等于總的實(shí)際數(shù)（作為限制條件，必須從總的自由度中減1），需要估計(jì)的參數(shù)實(shí)際上只有等位基因頻率a，其余等位基因和全部基因型頻率都可以由其推算出，所以需要估計(jì)的參數(shù)數(shù)目為1，df=總的分類數(shù)（即基因型的數(shù)目）一1（需要估計(jì)的參數(shù)數(shù)目1。PPA RG基因所篩選的SNPs位點(diǎn)中除了rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs -9870196、rs17036700、rs4135304、rs4135343位點(diǎn)以外，其他23個位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性（P>0.05）（見表1）。

2）對新疆地區(qū)50例維吾爾族無關(guān)個體進(jìn)行SNP分型檢測獲得31個SNP位點(diǎn)的基因型。

采用直接記數(shù)法計(jì)算，得到每個位點(diǎn)的最小等位基因頻率（MAF）。rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs9870196、rs17036700位點(diǎn)第1個等位基因頻率為1，第2個等位基因頻率都為0。rs4135304、rs4135343位點(diǎn)第1個等位基因頻率為0，第2個等位基因頻率都為1（見表3）。

3）進(jìn)一步對具有多態(tài)性的23個位點(diǎn)進(jìn)行基因型頻率分布計(jì)算。

在23個SNP位點(diǎn)中，rs1899951、rs2292101、rs-2881654、rs1801282等位點(diǎn)的第一個純合體基因型頻率最高，頻值0.74，rs6782475、rs7626560等位點(diǎn)的第一個純合體基因型頻率最低，頻值均為0。在雜合體中rs17036242、rs7615916、rs9310401等位點(diǎn)的雜合體基因型頻率最高，頻值分別為0.60、0.63、0.60。rs6782475位點(diǎn)雜合體基因型頻率最低，頻值均為0.12。在第2個純合體中，rs3856806、rs6782475等位點(diǎn)的基因型頻率最高，頻值分別為0.68、0.88。rs17036242、rs1899951、rs-2292101、rs2881654、rs9310401、rs1801282等位點(diǎn)基因型頻率最低，頻值均為0—0.02（見表4）。

4）采用SPSS軟件X2檢驗(yàn)進(jìn)行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率計(jì)算。

在rs2292101位點(diǎn)第2個純合體的基因型在男和女都為0，所以無法進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，rs6782475、rs7626560位點(diǎn)第一個純合體的基因型在男和女都為0，所以無法進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，其他位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在男女組間的差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表5）。

3討論

過氧化物酶體增殖物活化受體y（PPA R-y），也稱胰島素增敏劑受體，是一種位于人類染色體上的二型核受體，由PPARG基因編碼，對脂肪細(xì)胞和胰島素有重要的作用，是治療糖尿病的研究對象之一[16-22]。PPA R-y通過JAK -STAT、激活蛋白-1（AP-1）、NF-rd3、活化T細(xì)胞核因子信號通路（NFAT）來抑制炎癥反應(yīng)；通過抑制泡沫細(xì)胞的分化、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖來抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；通過磷脂酰肌醇三激酶（P13K）、瘦素、脂鏈素等信號通路來參與糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)；通過細(xì)胞周期的調(diào)控來影響腫瘤生長；參與脂肪細(xì)胞分化并與肥胖密切相關(guān)。明確這些相關(guān)信號通路以及相關(guān)細(xì)胞因子的作用，可對相關(guān)疾病機(jī)制及防治進(jìn)一步提供有力依據(jù)和干預(yù)途徑[23]。

代謝綜合征是臨床上具有肥胖、高血壓、血脂紊亂、受損的糖耐量或糖尿病以及胰島素抵抗等一系列代謝失常癥狀的并稱，是多種代謝成分異常聚集的的病理狀態(tài)。引起上述代謝失常癥狀的因素有很多，包括胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、脂肪組織分泌的各種細(xì)胞因子的參與、生活方式及遺傳因素等，但其根本原因還是能量代謝的失衡[24-26]。因此，代謝綜合征治療手段的探索和相關(guān)藥物的開發(fā)已成為國內(nèi)外科學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究中，從新疆維吾爾族人群50例無關(guān)個體提取血液DNA，使用Haploview 4.1分析軟件，對過氧化物酶體增殖物激活受體（ PPARG）相關(guān)SNP位點(diǎn)篩選，為了避免由于SNP的MAF過低而產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)偏倚，首先考慮納入（最小等位基因）MAF>0.05的多態(tài)位點(diǎn)，并根據(jù)多人群研究情況選擇熱點(diǎn)多態(tài)性位點(diǎn)優(yōu)先進(jìn)入候選分型。結(jié)果顯示，篩選的31個位點(diǎn)中rs1151999、rs1175540、rs17036242、rs1875796、rs1899951、rs2292101、rs -2881654、rs2921190、rs2938397、rs2959272、rs295 -9273、rs2972162、rs3856806、rs4135247、rs4135275、rs4684846、rs6782475、rs709151、rs7615916、rs76 -26560、rs9310401、rs9817428、rs1801282等23個位點(diǎn)具有多態(tài)性。在男女組間23個SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率差異均沒達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

目前，我們只是對以上SNP位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群的多態(tài)性特征進(jìn)行了調(diào)查，為進(jìn)一步的群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)，并為今后進(jìn)行疾病前瞻性研究提供了重要的基礎(chǔ)資料，但是，這些位點(diǎn)與過氧化物酶體增殖物激活受體的相關(guān)性如何，有待于進(jìn)一步研究。

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