劉欣春 李杰 裴磊 王森 彭云飛

摘 要：檢測血管生成素1（angiopoietml，Angl）對體外培養(yǎng)脊髓微血管內(nèi)皮細胞（spinal cord nucrovascular en-dothelial cell，SCMEC）屏障功能的調(diào)節(jié)機制。體外分離培養(yǎng)大鼠SCMEC及膠質(zhì)細胞，通過雙室培養(yǎng)系統(tǒng)建立體外血一脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）模型；分別用Angl及Angl+wortmannin（Akt抑制劑）處理培養(yǎng)細胞，Western-blot檢測Akt及連接蛋白質(zhì)的表達：放射自顯影檢測Akt激酶活性變化：測定跨內(nèi)皮電阻（TEER）反映各組細胞屏障功能；細胞免疫熒光檢測連接蛋白在細胞接觸面的分布變化；免疫共沉淀實驗分析連接蛋白之間的相互作用改變。結(jié)果顯示，Angl處理組細胞Akt活性及TEER值均有明顯升高，Angl處理后ZO-1及VE-cadherin在細胞連接處的分布增強，occludin/ZO-l、VE-cadherin/p-catenin之間的相互作用均較對照組顯著增強，且以上Angl處理所引起的SCMEC功能改變均可被wortmannin所拮抗。表明Angl通過Akt活性調(diào)節(jié)SCMEC連接蛋白的分布及相互作用，從而影響體外BSCB的屏障功能。

關(guān)鍵詞：血一脊髓屏障；血管生成素l（ Angl）；Akt

中圖分類號：R33 8.2+1 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0218-06 脊椎動物的血一脊髓屏障（ blood-spinal cordbamer，BSCB）是血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的延伸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的屏障結(jié)構(gòu)。BSCB由脊髓微血管內(nèi)皮細胞（spinal cord mi-crovascular endothelial cell，SCMEC）間的緊密連接及星形膠質(zhì)細胞周足構(gòu)成，可有效地阻止血液中的大分子進入脊髓實質(zhì)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供穩(wěn)定的微環(huán)境[I]?，F(xiàn)有研究表明，多種脊髓病變與BSCB屏障功能異常有關(guān)，如創(chuàng)傷性脊髓損傷[2，3]、放射性損傷[4] 、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥[5，6] 、感染[7J等。內(nèi)皮細胞間的連接蛋白及細胞骨架是構(gòu)成內(nèi)皮細胞屏障的主要分子基礎(chǔ)，其表達量、分布及相互作用的改變是導致內(nèi)皮細胞通透性增高的直接原因[8] 。

血管生成素（ angiopoietin，Angl）是一種有效的血管生成因子，參與血管生成的各個階段，許多其他血管生成因子可通過Angl誘導新血管的生成。在血腦屏障，Angl作用于Tie-2酪氨酸激酶受體，參與維持屏障完整性及血管穩(wěn)定[9，10]；近期有研究報道，Angl可通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-2（zonula occludens-2）穩(wěn)定腦微血管內(nèi)皮細胞哦在非中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管內(nèi)皮細胞，Angl可通過PI3 K/Akt途徑發(fā)揮抗凋亡[12]及維持血管穩(wěn)定性的作用[l3]。本研究以分離培養(yǎng)的大鼠SCMEC為研究對象，在體外建立BSCB模型，探討Angl-Akt途徑對血脊髓屏障的通透性影響并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

成熟Sprague-Dawley大鼠（275～300 g）由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。DMEM/F12培養(yǎng)基為Sigma公司（美國）產(chǎn)品；堿性成纖維細胞生長因子（ bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管生成素l（Angl）購自Peprotech公司（美國）；Wort-mannln購自Gene Operation（中國）；蛋白G瓊脂糖購自Pierce公司（美國）；PKA抑制肽購自Merck Millipore公司（德國）；組蛋白H2B為EnzoLife Sciences公司（瑞士）產(chǎn)品；y-32PlATP購自北京福瑞生物科技有限公司（中國）；兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO—1、盧-catenin抗體、驢抗兔IgG（ FITC）、Prolong Gold Antifade封片劑購自Invit-rogen公司（美國）；山羊抗大鼠Aktl、p-actin、兔抗大鼠pAk[抗體、?？股窖騃gG（ HRP）、?？雇肐gG（HRP）購自Santa Cruz公司（美國）；兔抗大鼠VE-cadherin購自Abcam公司（美國）；DC蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司（美國）；增強型化學發(fā)光試劑盒購自Pierce公司（美國）；其他常規(guī)試劑為Sigma公司（美國）產(chǎn)品。

1.2主要儀器設(shè)備

Millicell～ ERS-2細胞電阻儀；MiⅡipore Milli-cell插入式細胞培養(yǎng)皿；Beckman液閃計數(shù)儀；Bio-Rad電泳儀及電泳槽；Eppendorf臺式低溫離心機；蘇凈VS-1300U超凈臺；Thermo ScientificSeries8000 C02細胞培養(yǎng)箱；Olympus BX51熒光顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細胞（SCMEC）的分離培養(yǎng)

按本實驗室常規(guī)方法分離培養(yǎng)大鼠SCMEC。成熟SD大鼠C02窒息處死，手術(shù)分離椎管后注射冷D-Hanks液以分離脊髓組織，去除腦脊膜及大血管。冷DMEM/F12培養(yǎng)液中剪碎組織至1 mm3大小，冰上勻漿后于37 °C水浴膠原酶Ⅱ消化30 min。消化產(chǎn)物200 g離心5 min，220/o BSA重懸組織沉淀，2 000 g離心10 min，棄上層髓磷脂成分，DMEM/F12清洗下層血管組織。無菌濾器（BD Falcon，295 lim及40 μm）依次過濾以進一步去除大血管及血細胞，收集微血管組分。0.1%膠原酶及脂肪酶于37 0C消化脊髓微血管30 min.間歇攪拌并鏡下觀察，待內(nèi)皮細胞出芽呈串珠樣時1000xg離心5 min終止消化。SCMEC培養(yǎng)液（DMEM/F12、1 0%胎牛血清、10%馬血清、2 mmol/L谷氨酸鈉、l g/L肝素、1μg/L bFGF、10 μg/L VEGF、50 mg/L慶大霉素、3p，mol/L嘌呤霉素）重懸消化后的微血管組分，接種于預鋪IV型膠原及纖連蛋白（均為5 μg/cm2）的培養(yǎng)平板，接種密度為lx1 04/cm2。培養(yǎng)6d待細胞融合成單層后常規(guī)免疫熒光觀察因子Ⅷ表達情況，確定SCMEC分離培養(yǎng)純度> 95%。

0.125 010胰酶（含0.020/0 EDTA）消化SCMEC，按不同密度進行傳代：1）1：1接種于6孔培養(yǎng)板，用于蛋白樣品制備；2）1：5接種于6孔培養(yǎng)板（內(nèi)預置蓋玻片），用于細胞免疫熒光；3）1：1接種于Millicell插入小室，置于24孑L板（預鋪膠質(zhì)細胞）中，用于跨內(nèi)皮電阻（TEER）測定。所有培養(yǎng)細胞于37℃50/0 C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，每2—3 d更換培養(yǎng)液。

1.3.2血管生成素1（Angl）處理培養(yǎng)細胞

為檢測Angl對體外SCMEC屏障功能的影響，于培養(yǎng)第7d用Angl （0.1 mg/L）或Angl（ 100 mg/L） +Wortmannin（0.1 μmol/L）處理細胞12 h，于不同時間點（0、4、8、12 h）測量Angl處理后跨內(nèi)皮電阻變化，并收集SCMEC進行激酶活性測定及免疫印跡等檢測。

1.3.3 Akt激酶活性測定

通過測定Akt底物蛋白H2B的磷酸化狀態(tài)反映Akt激酶活性，具體如下：收集SCMFC制備蛋白裂解液，蛋白G瓊脂糖4℃預孵育30 min后加入抗Akt抗體免疫沉淀2h，離心后依次用裂解液、純水及激酶反應液（50 mmol/L HEPES、10 mmol/l_ MrlCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇、1μmol/L PKA抑制劑，pH 7.2）清洗沉淀。在反應液中加入20 μCi/mL[γ-32P]ATP及0.2g/L組蛋白H2B，30 °C孵育10 min。取25 μL反應液滴于Whatman p81陽離子交換濾紙，5%磷酸溶液終止反應，充分清洗后放人含10 mL蒸餾水的液閃瓶內(nèi)，Beckman液閃計數(shù)儀測定cpm值。

此外，本研究亦采用放射自顯影檢測Akt激酶活性，即在上述激酶反應液中加入50μCi/mL[γ-32P]ATP及組蛋白底物，30 0C孵育30 min后用SDS樣品緩沖液終止反應，SDS-PAGE分離蛋白成分后放射自顯影觀察H2B的磷酸化狀態(tài)。1.3.4跨內(nèi)皮電阻（TEER）測定

使用Millicell⑩ERS-2細胞電阻儀測量雙室培養(yǎng)系統(tǒng)中SCMEC跨內(nèi)皮電阻值，以反映其內(nèi)皮屏障功能及通透性。在Angl處理后不同時間點（每個時間點設(shè)置3個平行孔），將正負電極分別置于培養(yǎng)內(nèi)室及外室，記錄待測孔電阻值（Ru），按公式TEER=（Ru-Rc）xS計算各組TEER值（ Ω·cm2），其中Rc為未接種細胞空白孔電阻值，S為培養(yǎng)面積。

1.3.5免疫印跡及免疫共沉淀

收集各組SCMEC，Nonidet P-40裂解液（ 50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EG-TA，lO% glycerol.l% Nonidet P-40.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3V04，1μg/mL亮肽素，1 mg/L抑肽酶，pH 7.4）處理后提取總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度后制備蛋白樣品。每組按30 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳分離蛋白成分，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，依次經(jīng)一抗、二抗孵育后進行ECL顯色（p-actin做為內(nèi)參照）。

免疫共沉淀實驗中每組取400卜Lg蛋白裂解液，用2 yg兔IgG進行預處理，加入蛋白A瓊脂糖珠離心后，取上清加入2 μg IP抗體（ZO-1或VE -cadherin，另設(shè)無IP抗體IgG對照），室溫于旋轉(zhuǎn)混勻過夜，加入蛋白A瓊脂糖珠沉淀抗原抗體復合物，離心后用上樣緩沖液處理瓊脂糖珠，煮沸變性，SDS-PACE分離蛋白后按上述方法進行免疫印跡分析（抗occludin或抗p-catenin抗體）。

1.3.6 細胞免疫熒光

40/0多聚甲醛固定經(jīng)Angl處理12 h后的SCMEC，0.1% Triton-100通透，S%牛血清白蛋白封閉，依次經(jīng)抗ZO—1或VF -cadherin抗體及FITC標記IgG孵育后，Prolong Gold Antifade封片劑（含DAPI）封片，于Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.7統(tǒng)計學分析

本研究中TEER、免疫印跡、放射自顯影等實驗結(jié)果均采用GB-STAT軟件（Dynamic Microsys-tems）進行雙因素方差分析及Dunnett's檢驗，P<0.05為差異顯著，P

2結(jié)果

2.1 Angl處理增強體外培養(yǎng)SCMEC中Akt激酶活性

體外分離大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細胞（SCMEC），建立體外血一脊髓屏障。由于在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞系中Angl可通過Akt-PI3K途徑影響內(nèi)皮細胞活力及血管生成過程[1]，在本研究中我們首先檢測了Angl對SCMEC中Akt活性的影響。分別用Angl、Angl+Wortmannin（ WM，PI3K/Akt途徑抑制劑）處理傳代培養(yǎng)第7d的SCMEC單層，預處理后Oh、4h、8h、12 h收集各組細胞。免疫印跡結(jié)果顯示，Angl處理4h后，Aktl磷酸化水平與對照組相比有明顯升高，Wortmannin則可抑制Angl引起的Aktl磷酸化（圖1A、C）；以組蛋白H2B為底物，放射自顯影（圖1B）及液閃計數(shù)（圖1D）均顯示Angl處理后，Akt活性有顯著增高。該結(jié)果說明，Angl在本研究分離培養(yǎng)的SCMEC中可以活化Akt，且該作用可被Wortmannin所抑制。

2.2 Angl通過影響Akt活性增強體外培養(yǎng)SCMEC屏障功能

為確定Angl-Akt通路對BSCB屏障功能的影響，在Angl處理雙室培養(yǎng)的SCMEC后不同時間點測定跨內(nèi)皮電阻（ TEER）。結(jié)果顯示，Angl處理后4h，SCMEC單層上皮TEER值與對照組相比明顯升高，即Angl可增強體外培養(yǎng)SCMEC屏障功能；此外，該效應可被Wortmannin所拮抗，即與Angl處理組相比，Angl+WM組TEER值有所下降（圖2）。該結(jié)果表明，Angl可能通過影響Akt.活性增強體外培養(yǎng)SCMEC屏障功能。

2.3 Angl-Akt通路影響連接蛋白在SCMEC細胞連接處的分布

為進一步明確Angl-Akt途徑影響SCMEC屏障功能的機制，我們檢測了幾種細胞連接蛋白（occluclin、ZO-1、VE -cadherin、β-catenin等）經(jīng)Angl處理后在細胞連接處的分布變化。為更清晰地觀察細胞接觸面，我們在細胞免疫熒光試驗中采用1：5比例進行傳代培養(yǎng)，在該培養(yǎng)條件下，SCMEC大多（>600/0）呈現(xiàn)多角形。結(jié)果表明，緊密連接蛋白ZO-1及粘著連接蛋白VE-cadherin在Angl處理后在細胞連接處的分布顯著增強，而Angl+WM組則無此改變（圖3），提示Angl可通過Akt活性影響連接蛋白在細胞表面的分布，從而增強SCMEC的屏障功能。

2.4 Angl-Akt通路影響SCMEC連接蛋白間的相互作用

在觀察到Angl對ZO一1及VE -cadherin在細胞連接處的分布影響后，我們進一步通過免疫共沉淀檢測了細胞連接蛋白間的相互作用改變。在Angl處理12 h后，收集SCMEC裂解液，統(tǒng)計分析Co -IP結(jié)果顯示，Angl可以增強occludin/ZO-1及VE—cadherin/β-catenin之間的相互作用分別達200%及150%以上，而Angl+WM組與Angl處理組相比則抑制了連接蛋白間的相互作用，表明Angl-Akt途徑可通過促進細胞連接復合體的形成提高SCMEC的內(nèi)皮屏障功能（圖4）。

3討論

脊髓微血管內(nèi)皮細胞（SCMEC）在構(gòu)成血脊髓屏障（BSCB）中的功能與腦微血管內(nèi)皮細胞（BMEC）構(gòu)成血腦屏障（BBB）中的作用類似，近年來在血中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障的研究中建立了許多成功模擬BBB或BSCB的體外模型[1416]。本研究通過分離培養(yǎng)成熟SD大鼠脊髓微血管，在適當條件下消化培養(yǎng)SCMEC，經(jīng)因子Ⅷ特異性抗體檢測，SCMEC純度可達95%[14，15]；在此基礎(chǔ)上，于雙室培養(yǎng)系統(tǒng)中共培養(yǎng)SCMEC和膠質(zhì)細胞（已知后者可誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的形成[17]），通過每日測定TEER反映內(nèi)皮屏障功能，發(fā)現(xiàn)在該培養(yǎng)條件下經(jīng)6—7 d的培養(yǎng)，TEER值可達45—60Ω·cm2，表明成功建立體外BSCB模型。

Angl基因位于染色體8q22，由498個氨基酸組成，主要由周細胞及血管平滑肌細胞表達，作用于內(nèi)皮特異性酪氨酸激酶受體Tie-2，其同源蛋白Ang2為其天然的競爭性拮抗劑。轉(zhuǎn)基因研究證實，Angl基因缺失或Tie-2基因敲除的小鼠胚胎血管形成障礙、通透性增高且缺乏連續(xù)性從而不能形成血管網(wǎng)；而Angl過表達的轉(zhuǎn)基因動物則表現(xiàn)為血管增生變粗且內(nèi)皮細胞與周細胞的連接完整[18]。Angl在維持血管穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，有報道稱其中涉及Akt介導的抗凋亡效應[9，12]；此外，Angl可通過激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）引起柱蛋白（paxillin）磷酸化，加強內(nèi)皮一基質(zhì)間的相互作用，增加內(nèi)皮管狀結(jié)構(gòu)的完整性。在本研究中，我們首先檢測了Angl對體外培養(yǎng)的脊髓微血管內(nèi)皮細胞Akt激酶活性的影響，即用Angl處理培養(yǎng)SCMEC后收集細胞裂解液，采用[32P]-摻入試驗測定激酶活性，放射自顯影及液閃計數(shù)結(jié)果均顯示Angl處理后可引起SCMEC中的Akt活性增高。結(jié)合以往報道，該結(jié)果提示Angl對PI3K/Akt途徑的調(diào)節(jié)作用在內(nèi)皮細胞中是普遍存在的。在此基礎(chǔ)上，我們又進一步檢測了Angl對體外BSCB屏障功能的影響，TEER測定結(jié)果表明Angl處理4h后，SCMEC屏障功能顯著增強，同時發(fā)現(xiàn)該作用可被PI3 K/Akt途徑特異性抑制劑Wortmannin所拮抗，說明Angl可通過影響Akt活性調(diào)節(jié)BSCB功能，降低其通透性，維持BSCB的穩(wěn)定。

在內(nèi)皮屏障結(jié)構(gòu)中，相鄰內(nèi)皮細胞間的細胞連接的形成及完整性對內(nèi)皮通透性的維持至關(guān)重要。因此，我們檢測了Angl處理后幾種連接蛋白（ occludin、ZO—1、ZO -2、VE -cadherin、β-catenin）的表達情況，免疫印跡結(jié)果顯示無明顯改變，說明Angl不是通過影響連接蛋白的表達量調(diào)節(jié)BSCB的通透性。進一步通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Angl處理后支架蛋白ZO-1與鈣黏蛋白VE -cadherin在細胞接觸面的分布明顯增加；此外，緊密連接蛋白occludin與ZO-1，以及VE -cadherin與連環(huán)蛋白β-catenin之間的相互作用也在Angl處理后增強，且Angl所引起的效應均可被PI3K-Akt途徑抑制劑Wortmannin所抑制。

綜上結(jié)果表明，Angl可通過Akt改變連接蛋白在SCMEC細胞連接處的分布狀態(tài)，并影響連接蛋白之間的直接作用，從而改變BSCB的通透性及屏障功能，該結(jié)論仍需進一步在體內(nèi)研究中進行驗證。此外，Angl還可通過其他途徑參與維持血管穩(wěn)定性及誘導新血管生成，如有研究表明Angl可促進胞漿素和金屬基質(zhì)蛋白酶一2（MMP-2）的分泌和基底膜的降解，從而促進內(nèi)皮遷移和管狀結(jié)構(gòu)生成，還可通過降低血小板內(nèi)皮細胞粘附分子（ PECAM）的磷酸化加強內(nèi)皮間的連接，維持微血管壁的完整性[19]等等，這些信號轉(zhuǎn)導分子在Angl調(diào)節(jié)BSCB屏障功能的過程中是否發(fā)揮作用仍需進一步的研究闡明。