武秀香等

摘要[目的]探討鈣蛋白酶1（CAPN1）基因在中國黃牛不同群體中的變異以及CAPN1基因作為影響牛肉質(zhì)性狀候選基因的可能性，尋找與牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標記。[方法]采用PCRSSCP對雷瓊牛、云南高峰牛、BMY牛與中國西門塔爾牛共367個個體CAPN1基因Exon11Exon16與Intron21遺傳變異檢測，運用GLM模型分析檢測到的遺傳變異與中國西門塔爾牛部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。[結(jié)果] 發(fā)現(xiàn)CAPN1基因DNA序列中的2個突變位點A4558G和C4684T，分別檢測到AA/AG/GG和CC/CT/TT 3種基因型，優(yōu)勢基因分別為A和G。效應分析結(jié)果表明， A4558G多態(tài)對骨重、胴體產(chǎn)肉率及肉骨比性狀效應顯著（P<0.05），C4684T多態(tài)對宰前活重、凈肉重、胴體重、頭重、骨重、前蹄重、網(wǎng)膜油重及腸系膜油重性狀效應顯著（P<0.05）。[結(jié)論]CAPN1基因可以作為肉牛胴體性狀的主效基因或與主效基因相連鎖的一個標記。

關(guān)鍵詞鈣蛋白酶1基因；群體遺傳分析；胴體性狀；SNP

中圖分類號S813.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）29-054-03

鈣蛋白酶 （Calcium activated neutral protease，CAPN），是一種廣泛存在于動物細胞中的蛋白水解酶，在機體發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉生長、細胞信號轉(zhuǎn)導與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。CAPN首次發(fā)現(xiàn)于大鼠腦組織中，目前已對其結(jié)構(gòu)及表達進行了大量研究。CAPN參與了肌肉中肌原纖維的水解過程，因此也直接參與了肌肉生長和畜禽屠宰后嫩化的過程。鈣蛋白酶能降解肌原纖維蛋白，因此推測其可能通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解而對其結(jié)構(gòu)和功能進行調(diào)控。Calpain是活體肌肉組織中導致肌纖維降解的關(guān)鍵因素。Doumit和Koohmaraie認為鈣蛋白酶可能通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解。Richard認為肌原纖維被鈣蛋白酶降解釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體降解。目前，有關(guān)CAPN1基因與牛肉肉質(zhì)（如IMF）的遺傳相關(guān)性已有大量研究，但關(guān)于這一基因?qū)θ馀ｋ伢w性狀的效應則未見報道。基于此，筆者對CAPN1基因?qū)χ袊鏖T塔爾牛胴體性狀的效應進行了系統(tǒng)分析。筆者以分析CAPN1基因在中國西門塔爾牛、云南高峰牛、雷瓊牛和BMY牛等4個中國黃牛群體中的遺傳變異水平為手段，探討該基因?qū)χ袊鏖T塔爾牛胴體性狀的效應，以期找出肉牛肉用性能的獨特遺傳標記，為培育我國黃牛肉用新品系提新的供理論依據(jù)與支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1血樣采集與屠宰測定。共采集了黃牛血樣367份，頸靜脈采血8 ml，肝素鈉抗凝，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采集群體均為成年牛，其樣本采集地區(qū)與規(guī)模分別為：內(nèi)蒙古自治區(qū)的中國西門塔爾牛132頭，云南省草地動物科學研究院育成中的BMY牛81頭，云南省思茅地區(qū)云南高峰牛80頭，海南省瓊中縣雷瓊牛保種場雷瓊牛74頭。另外，中國西門塔爾牛屠宰后經(jīng)排酸嫩化處理（4 ℃、24 h），根據(jù)文獻[12]的方法測定相關(guān)屠宰指標。

1.1.2試驗試劑。試驗試劑均購自TaKaRa 公司（大連）（除注明出處外）。

1.1.3引物設計。涉及的引物均參照文獻[8]。

1.2DNA提取采用常規(guī)酚氯仿提取法，依據(jù)文獻[13]中方法提取采集血液樣本中的基因組DNA，并依據(jù)測定濃度進行濃度校正。

1.3PCR-SSCP與測序

PCR反應體系：總體積20 μl，10×buffer 2.0 μl、dNTP（10 mmol/L）0.5 μl、Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.3 μl、上下游引物各（10 pmol/μl）1.0 μl、模板DNA（100 ng/μl）1.0 μl、ddH2O 14.2 μl。PCR反應程序：95 ℃預變性，5 min；94 ℃變性 40 s，58 ℃復性 40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃，下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后，取2 μl于滅菌離心管中，加入6 μl變性上樣緩沖液（95%去離子甲酰胺）、10 mmol/L EDTA（pH 8.0）、0.25%二甲苯青FF、0.25%溴酚藍，98 ℃ 變性10 min，冰浴至上樣時取出。10% Acr-bis（29∶1）聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V 14 h，銀染后判型。

SSCP分型后，每個基因型隨機挑選2個樣本，用DNA回收試劑盒（TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）純化后回收，正反向直接測序（上海生物工程技術(shù)有限公司）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS17.0軟件，一般線性模型（General linear model，GLM）分析各基因型與測定胴體性狀指標之間的相關(guān)性，采用以下模型：Yijk=μ+Markeri+Agej+eijk。其中，Yijk為個體表型記錄，μ為群體均值，Markeri為基因型效應與基因型組合效應，Agej為年齡效應，eijk為隨機誤差。

2結(jié)果與分析

2.1CAPN1基因的SNP分型

分別對中國西門塔爾牛、雷瓊牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因進行PCR-SSCP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個多態(tài)位點（圖1）。根據(jù)試驗結(jié)果，選取帶型特征明顯的樣本，進行測序分析，并與GenBank序列（登錄號為AF248054）進行比對。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，中國西門塔爾牛、雷瓊牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因分別在4 558 bp和4 684 bp處出現(xiàn)了C/T堿基突變與A/G堿基突變（圖2）。

2.2群體間基因分布由表1可知，CAPN1 A4558G位點優(yōu)勢基因為A，優(yōu)勢基因型為AA型。CAPN1 C4684T位點優(yōu)勢基因為C，但群體間基因分布情況不同，本地黃牛群體為CC型，培育群體為CT型。

2.3CAPN1基因與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析由表2可知，CAPN1的A4558G位點遺傳變異與骨重、胴體產(chǎn)肉率及肉骨比顯著相關(guān)，其中骨重性狀GG基因型顯著低于雜合型個體AG （P<0.05）。從胴體產(chǎn)肉率和肉骨比來看，GG型個體顯著高于AG型個體（P<0.05），與AA型個體差異不顯著（P>0.05）。CAPN1的C4684T位點遺傳變異與宰前活重、胴體重、骨重、凈肉重、頭重、前蹄重、胃重、腸系膜油重及網(wǎng)膜油重顯著相關(guān)，其中CT基因型個體宰前活重、胴體重、頭重及網(wǎng)膜油重的性狀顯著高于TT型個體（P<0.05）；凈肉重、骨重、胃重CT型高于CC型（P<0.05）；前蹄重CT型顯著高于CC和TT型（P<0.05）；腸系膜油重TT型顯著高于CC型（P<0.05）。

3討論

作為影響牛肉肉質(zhì)的主效基因之一，鈣蛋白酶在牛肉的成熟嫩化過程中是重要的內(nèi)源蛋白酶之一。長期以來，CAPN1基因其遺傳變異對肉嫩度效應的相關(guān)研究頗多。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因的優(yōu)勢基因型組合對大理石花紋評分和剪切力2個性狀效應低于其他基因型組合3.20%和15.22%（P<0.05），具有較高的培育潛力。然而，CAPN1與肌肉生長性狀關(guān)聯(lián)分析的研究較少。筆者在前期試驗研究的基礎上，進一步分析了CAPN1基因2個SNP位點對中國西門塔爾牛主18個胴體性狀的遺傳效應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A4558G位點的遺傳變異對胴體重與宰前活重等重要胴體性狀具有顯著效應，同時也發(fā)現(xiàn)腸系膜油與網(wǎng)膜油重等脂肪相關(guān)性狀也有特定效應，說明機體脂肪沉積過程中CAPN1基因發(fā)揮了一定作用，也從側(cè)面證實了CAPN1基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)系，初步確定CAPN1基因可以作為調(diào)控我國肉牛部分屠宰性狀的主效應基因或與主基因緊密連鎖。這些證據(jù)從另外一個角度證實了CAPN1基因?qū)θ馀Ｉa(chǎn)性狀的改良具有重要理論意義。

4結(jié)論

通過對牛CAPN1基因2個變異位點在中國北方南方黃牛群體中群體遺傳分析以及與中國西門塔爾牛肉質(zhì)性狀的效應分析，進一步證實CAPN1基因作為牛肉用性能的遺傳標記具有重要的理論意義。

安徽農(nóng)業(yè)科學2015年

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