張立杰　陳秀萍　鄭姍　謝麗雪　張小艷　李韜

摘 要 應用SRAP技術開發(fā)了龍眼指紋檢索系統(tǒng)并進行了遺傳多樣性分析。12對引物組合在16份龍眼及龍荔種質(zhì)中共擴增出257條DNA帶，其中248條為多態(tài)帶（占96.5%），平均每個引物擴增多態(tài)性帶20.7條。17份材料間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.399～0.871。利用Me6Em7、Me5Em4、Me2Em8等3對引物開發(fā)的指紋檢索系統(tǒng)，可以區(qū)分全部17份種質(zhì)。根據(jù)相似系數(shù)進行聚類分析，16個龍眼品種和龍荔分成2大組，龍眼品種間的聚類結果基本反映了供試材料之間的親緣關系。

關鍵詞 龍眼；SRAP；指紋檢索系統(tǒng)；遺傳多樣性

中圖分類號 S667.2 文獻標識碼 A

龍眼在植物分類學上屬于無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus longana Lour.）。中國龍眼種質(zhì)資源極為豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計，有400多個品種（系）[1]。近些年來，隨著龍眼審定品種的增多以及各地品種的大量引進、頻繁交換過程中表型特征可能受環(huán)境影響而發(fā)生改變，有些品種會出現(xiàn)很大的相似性而使鑒定的準確性受到影響，導致同名異物和同物異名。保證品種的真實性、維護生產(chǎn)者與育種家的權益顯得日趨重要，因此亟需準確的種質(zhì)和品種鑒定方法。

DNA指紋圖譜具有多位點性、高變異性和簡單穩(wěn)定的遺傳性，因而自其誕生就引起了人們的重視，表現(xiàn)出巨大的實用價值[2]。利用RAPD[3-4]、AFLP[5-6]和ISSR[7-10]技術進行龍眼種質(zhì)資源親緣關系和品種鑒別的研究已有若干報道，但是有關龍眼SRAP分子標記技術的研究卻鮮有報道[11-12]。

本研究以國內(nèi)外16個龍眼商業(yè)品種以及近緣種龍荔[Dimocarpus confinis（How et Ho）]為試材，初步開發(fā)了龍眼品種的SRAP指紋圖譜檢索系統(tǒng)，為龍眼品種的快速準確鑒定及資源創(chuàng)新和育種實踐提供分子依據(jù)，同時也為中國龍眼種質(zhì)資源的保護和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自國家果樹種質(zhì)福州龍眼圃的17份種質(zhì)（表1）。供試材料的嫩葉采集后，帶回實驗室提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取龍眼基因組DNA[13]，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳（1%）檢測DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 SRAP-PCR體系及擴增程序 引物序列參考王剛等[14]和Sun等[15]的方法，由上海生工生物工程服務有限公司合成。反應體系及擴增程序參考高慧穎等[16]的方法，25 μL的PCR反應體系中，含1×buffer，dNTP 200 μmol/L、上、下游引物各30 ng、MgCl2 2.5 mmol/L、Taq酶1.0 U和模板DNA 20 ng。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，33 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，53 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳后溴化乙錠（EB）染色法檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)電泳結果，每個樣品中存在的穩(wěn)定條帶記作1，缺失的記作0，強帶和可重復弱帶均記作1，采用Excel統(tǒng)計軟件建立原始數(shù)據(jù)0、l矩陣。根據(jù)二元數(shù)據(jù)計算單位引物擴增的條帶、多態(tài)性條帶及多態(tài)性條帶百分率， 用NTsys pc2.10e軟件進行遺傳相似性系數(shù)計算，按非加權成對算術平均法（UPGMA）建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SRAP標記的多態(tài)性分析

從120對引物組合中篩選出能產(chǎn)生清晰擴增產(chǎn)物、多態(tài)性較好的引物組合12對（表2）。利用12對引物組合對供試17份材料基因組DNA進行擴增，各樣品均可以擴增出重現(xiàn)性好、多態(tài)性明顯的條帶。共擴增出257條清晰可用的條帶，其中多態(tài)性條帶248條，占總帶數(shù)的96.5%。平均每個引物組合產(chǎn)生21.4條帶和20.7條多態(tài)性帶（表3）。不同引物擴增的DNA片段大小為50～1 300 bp，圖1為Me6Em7所揭示的不同品種的擴增圖譜。

2.2 品種鑒別及指紋檢索系統(tǒng)開發(fā)

從12對引物的擴增結果看，各引物具有較高的品種鑒別力，但單一引物均無法區(qū)分所有供試品種。16份龍眼品種中，僅二造龍眼可利用引物Me3Em3（250 bp、260 bp）（圖2）、Me5Em4（500 bp）、Me7Em11（260 bp）及Me8Em11（700 bp）等擴增出特殊位點，可由此直接鑒定出二造龍眼。說明二造龍眼與其它品種的遺傳差異較大，遺傳多樣性相對較高，作為親本可以拓展龍眼育種的遺傳基礎。

此外，利用Me6Em7、Me5Em4、Me2Em8 3對引物，根據(jù)擴增條帶的位點及品種帶型開發(fā)了15個龍眼品種的指紋檢索系統(tǒng)（圖3），根據(jù)檢索系統(tǒng)，可逐步鑒別這些品種。

2.3 遺傳相似性系數(shù)分析和聚類分析

16份龍眼品種及龍荔的遺傳相似性系數(shù)變化范圍在0.40～0.87。其中血絲龍眼和紅沙本之間遺傳相似性系數(shù)最大，為0.871；紅沙本和龍荔之間相似性系數(shù)最小，為0.399；與龍荔相似性系數(shù)最大的龍眼品種為中優(yōu)1號，為0.555。

在龍眼種內(nèi)，二造龍眼與其他品種之間的相似性系數(shù)最小，平均值為0.634，其中二造龍眼和中優(yōu)1號二者的相似性系數(shù)最小，為0.597；與其他品種之間的相似性系數(shù)最大的是桂香，平均值為0.757。

基于SRAP的擴增結果，用UPGMA法進行聚類分析，得到17份供試材料的親緣關系樹狀圖（圖4）。從聚類圖可以看出，以0.56的遺傳相似系數(shù)為闕值，供試材料聚為2大類：龍荔和龍眼品種群。以0.72為闕值，供試材料聚為4大類：龍荔、中優(yōu)1號、冰糖肉和其他龍眼品種群。以0.74為闕值，供試材料聚為5大類：龍荔，中優(yōu)1號，冰糖肉，第四類包括血絲龍眼、紅沙本、鳳梨味、松風本、博白大廣眼、歪嘴、儲良和鳳梨朵等8個品種，第五類包括四季龍眼、桂香、中優(yōu)1號、細核龍眼、赤殼和西埔本等6個品種。

3 討論與結論

近年國內(nèi)外報道用RAPD[17]、AFLP[18]、ISSR[19]及SSR[20]等分子標記分別在蔬菜、作物、花卉及果樹上開發(fā)指紋檢索系統(tǒng)，分別用來鑒定花椰菜品種、鷹嘴品種、銀葉樹品種及櫻桃品種，而國內(nèi)外尚未見用SRAP分子標記開發(fā)指紋檢索系統(tǒng)的報道，在果樹上應用也是空白。用3對SRAP引物開發(fā)的指紋檢索系統(tǒng)能使16個龍眼品種相互區(qū)分，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，具有準確、周期短、方法直觀易行且不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點。目前國家果樹種質(zhì)福州龍眼圃收集保存了包括栽培種、野生種、優(yōu)良株系在內(nèi)的種質(zhì)資源超過200個品種（系）[21]，隨著資源收集數(shù)量的增加，如何對新收集的資源進行快速、準確的分類、評價，成為當前國家圃面臨的急迫問題。本文通過對SRAP指紋檢索系統(tǒng)技術的應用進行探討，以期建立國家圃龍眼的分子分類檢索系統(tǒng)，為資源收集、整理，快速入圃服務，為雜交育種提供依據(jù)，提升國家圃的資源利用效率。

植物間SRAP隨機引物通用在某種程度上能反映出一定的親緣關系。易干軍等[5]通過AFLP分子標記技術研究發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)0.54時龍荔和龍眼聚在一起；高慧穎等[16]運用 RAPD標記技術研究表明在相似系數(shù)0.59的水平上龍荔能夠與龍眼聚在一起。本研究在16個龍眼品種和龍荔上的聚類結果也表明，龍荔與龍眼之間存在一定的親緣關系。同時也看到，聚類結果未能完全反映材料之間的地理來源，形成了地區(qū)間的重疊，表明材料的遺傳遺傳距離與地理距離相關性不明顯。

16個龍眼品種的擴增結果表明，只有二造龍眼具有特殊帶型或位點，說明參試品種的基因組位點差異不明顯，反映了參試品種遺傳基礎相對狹窄。本研究的參試品種都是性狀優(yōu)良或具特異性狀的資源，不能代表資源圃的實際情況，對國家圃資源的分子分類檢索等工作有待進一步開展。

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