陳志宣, 龔國利

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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常見阿膠偽品的熒光PCR分子檢測

陳志宣, 龔國利*

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

在普通PCR擴增的基礎上，加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，使用Real-Time PCR技術對阿膠驢源性成分進行鑒定.將從樣品阿膠中提取出的DNA進行實時熒光PCR，使用豬、牛、羊、馬、兔、驢的引物和探針進行篩查，結果呈陽性的即為含有此種動物源性成分.市購的三種不同品牌的阿膠使用此方法豬、牛、羊、馬、兔均為陰性，驢為陽性結果.Real-Time PCR技術具有省時高效的優(yōu)點，可一次處理批量樣品.

阿膠; 熒光PCR; 檢測

0 引言

熒光PCR自1995年由美國Applied Biosystems公司推出開始問世，該技術不僅實現(xiàn)了PCR技術從定性到定量的飛躍，而且比普通PCR特異性更強、操作更加方便快捷，并有效地解決了常規(guī)PCR污染及對操作人員健康隱患的問題.目前,熒光PCR已經得到了較為廣泛的應用[1].

使用熒光PCR技術必須提到熒光定量PCR儀的使用.熒光定量PCR儀所用的光源為激光器光源，從而保證了高能穩(wěn)定且無干擾的熒光激發(fā).由一系列的濾鏡、透鏡和一個雙色鏡組成的光學系統(tǒng)將激發(fā)熒光聚焦到光譜儀上，而光譜儀以間隔的方式將這些熒光按照波長的不同來分開，由CCD相機讀取，與熒光定量PCR儀所連接的電腦上安裝的序列檢測應用軟件將從CCD相機中收集那些熒光信號[2]，并對數據進行分析.

熒光定量PCR技術在常規(guī)PCR的基礎上，在PCR擴增過程中加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團[3].探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5′端-3′端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步.

本實驗選取了市面上常見的三種品牌的阿膠，使用DNAMAN等軟件對驢物種進行特異性引物設計，然后對樣品阿膠進行Real-Time PCR，旨在從分子水平上對市售阿膠進行真?zhèn)舞b定[4,5].

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗材料

豬肉、馬肉、羊肉、牛肉、兔肉均購于就近農貿市場.收集市面上所售包括東阿阿膠在內的三種品牌的阿膠，產地、采樣地以及數量見表1所示.以上樣品采集后放置-80 ℃冰箱備用.

表1 采購樣品信息

1.1.2 主要試劑

所使用的試劑為氯化鈉、Tris鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、2-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉、醋酸鉀、氯仿、異戊醇、無水乙醇、十六烷基三甲基溴化銨、PVP、Tris堿、Tris飽和酚，試劑均在天津市紅巖化學試劑廠購買，以上試劑均為分析純.Gene Expression Master Mix為寶生物工程(大連)有限公司生產，引物和探針在上海捷瑞生物科技有限公司合成.

1.1.3 主要儀器

本實驗所使用到的儀器：研磨機(MM-301)，陜西環(huán)宇儀器設備有限公司；電子天平(TXB622L)，捷久計量衡器上海有限公司；高速冷凍離心機(TGL-16M)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；凈化工作臺(SW-CJ-1G)，蘇州凈化設備有限公司；紫外可見分光光度計(UV5200)，上海元析儀器有限公司；熒光定量PCR儀(ABI7500)，美國ABI公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 引物和探針設計

利用GenBank數據庫中已公布的馬科動物驢的基因組序列(圖1)，采用DNAMAN 6.0.3.99軟件進行序列比對，在保守區(qū)用Primer Express 5.0根據驢的基因組堿基序列的特異性設計驢的上下引物[6]和探針，引物和探針均由寶生物(大連)有限公司合成.驢以及其他五種動物的引物和探針[7]序列、Tm值與擴增片段大小見表2所示.

圖1 驢betaactin基因

表2 引物和探針DNA序列

物種引物和探針序列5'-3'Tm值/℃大小/bp驢正向引物反向引物探針CCATCCACCATATACGCATGATGCCCGCCCCTGACAATGATATTTGACCTACAACGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA56.957.567.4127豬正向引物反向引物探針TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAATTTGCGCATTGTGCGTCACCTATATACCGCCATCTTC57.855.669.2387牛正向引物反向引物探針ATATTTATGATATTTGTATAGGTTGAGTAAATACAAACACACTTTAAAACATCGAGGAGCCTGTTCCGTAATCGAT57.358.465.7263羊正向引物反向引物探針CCCTCCACAAACATAAGGAGCCCACCAATCTAGTTCAAGCACACTACAAAGTATCGC58.556.269.5320馬正向引物反向引物探針TCAAAGATGGTGGAGGAACGGTGCCCAAAAAATCAAAACGTAAATTAAGAAAGAGAGCTTAATT57.658.969.4367兔正向引物反向引物探針TGAAATGCCACAACTTGACACCTGTCATAAGAAGGGCAGATAGGACACCTTGCTAGGCCACACCCACGGG56.358.567.2230

1.2.2 DNA的提取與質量鑒定

由于阿膠為深加工品，特別是在其煎煮過程中驢皮的細胞組織被破壞，DNA部分被分解.所以本實驗選擇DNA得率較高的SDS提取法[8,9].用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測提取DNA的質量，并使用朗波-比爾光吸收定律來計算樣品DNA濃度[10].

已知A=-lgT=εbc，樣品濃度為c=A/εb，又知ε=0.020，在b=1 cm的情況下，c=A/(0.020×1)=50×A，所以初始樣品濃度為：50×A×稀釋倍數/1 000(mg/mL).

1.2.3Real-TimePCR擴增條件

使用寶生物(大連)有限責任公司合成的引物、探針、mix為原料進行Real-TimePCR擴增[11,12].反應體系為25μL，含mix10μL、去離子滅菌水10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探針1μL、模板DNA 2μL,點于同一96孔PCR板上[13,14].此反應在7 900 ht熒光定量PCR儀上進行，溫度控制程序為：95 ℃預變性4 min，45個循環(huán)95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸2 min[15].在96孔的點樣板上，每一個品牌的阿膠依次用驢、豬、牛、羊、兔、馬六種引物來擴增其序列，由于引物的特異性，擴增成功的小孔會被檢測到熒光信號，在顯示器上出現(xiàn)圖譜.為保證實驗結果的準確性，每種引物做三平行.

1.2.4 特異性實驗

分別以豬、牛、羊、馬、驢、兔的DNA(100 ng/μL)為模板按照方法1.2.3進行實時熒光PCR，來檢測引物和探針的特異性[16].

1.2.5 Real-Time PCR最小檢測限的測定

檢測限是檢測方法的重要性能指標，在使用Real-Time PCR儀時，為了使得檢測結果不受DNA濃度的干擾，需要測得PCR系統(tǒng)對阿膠中所提取的DNA最小檢測濃度.因此，利用濃度梯度分別進行點樣出圖，以儀器所能夠檢測到的最小DNA濃度作為Real-Time PCR儀的最小檢測限[17].阿膠DNA濃度梯度如表3所示.

表3 阿膠DNA濃度梯度

1.2.6 市售樣品的實際檢測

使用在藥房購買的三種品牌的阿膠，分別進行熒光PCR檢測，根據反應結束后檢測器檢測到的熒光信號所給出的譜圖與Ct值[18]，來分析樣品中是否含有該引物的物種成分.Ct值則可以反映DNA模板的質量、濃度與反應體系是否協(xié)調.Ct值過高，說明體系中模板濃度太小;Ct值過低，說明模板濃度太高，一般標準Ct值在25左右.

2 結果與討論

2.1 引物探針特異性

分別以豬、牛、羊、馬、驢、兔的DNA(100 ng/μL)為模板按照方法1.2.3進行實時熒光PCR，來檢測引物和探針的特異性.結果表明，六種動物來源的DNA檢測結果為陽性(圖2～圖7)，不使用此物種引物的其他物種在45個循環(huán)內均無出現(xiàn)擴增(表4)，可見針對目標物種的引物和探針的特異性良好.

表4 引物和探針特異性實驗

圖2 驢引物和探針特異性實驗

圖3 豬引物和探針特異性實驗

圖4 牛引物和探針特異性實驗

圖6 馬引物和探針特異性實驗

圖7 兔引物和探針特異性實驗

2.2 最小檢測限樣品DNA濃度的確定

使用表3的濃度梯度，將樣品稀釋到表中濃度，在260 nm的波長下測量其OD值，按上述朗波-比爾定律計算DNA濃度.

表5 DNA濃度梯度

圖8 DNA濃度與Ct值曲線

如表5所示，通過測得不同稀釋倍數的DNA溶液在260 nm處的吸光度值，根據朗波-比爾定律公式c=A/εb計算得知DNA濃度.圖8為在不同稀釋倍數下，DNA濃度與Real-TimePCR結果的Ct值形成的曲線.如圖所示，在Ct值為25時，對應的是4號，也就是稀釋15倍，此時的DNA濃度是PCR最適濃度為12.5mg/mL.Ct值曲線在后期有一個平臺期，這個時期PCR儀所顯示的數據已經不能夠說明實驗結果，此時的DNA濃度已經低于儀器檢測靈敏度，所對應的DNA濃度為3.8mg/mL,這個濃度為Real-TimePCR的最小檢測限.

2.3 市售樣品的實際檢測

使用上述方法將東阿、福膠、同仁堂三個品牌的阿膠進行熒光PCR檢測，每一個樣品都用豬、牛、羊、馬、驢、兔的引物與探針進行反應.結果如表6所示.

表6 市售阿膠樣品鑒定結果

圖9 市售阿膠樣品鑒定結果

如圖9所示，東阿、福膠以及同仁堂的阿膠驢源性成分均有檢出，而其余物種檢測結果均為陰性，說明市售的三種阿膠均不含有豬、牛、羊、馬、兔這五種動物源性成分.三種品牌的阿膠，每種做三組平行試驗結果為圖中所示九條陽性熒光曲線，這三種品牌阿膠的平均Ct值分別為：24.72、25.67、25.53，均在25上下波動，說明從阿膠中所提取的DNA為驢源性成分，為驢產品無疑.

3 結束語

阿膠中驢源性成分的鑒定屬于中藥材鑒定范疇，對于此類問題此前一般采用質譜或色譜分析的方法解決，但是這些鑒定方法存在技術操作復雜、鑒定準確性低以及重現(xiàn)性差等問題.目前，較先進的物種鑒定方法是采用分子技術手段.自從1985年Karny Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應以來，PCR技術已成為分子生物學研究中使用最多、最廣泛的手段之一，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環(huán).

使用不合適的PCR引物容易導致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶)，不出帶或出帶很弱等.現(xiàn)在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行，可以在本地計算機上運行引物設計專業(yè)軟件.

在本實驗中，對于驢物種基因片段的分析，應用DNAMAN 6.0.3.99、Primer Express 5.0、Oligo 6 等引物設計軟件得到一對能特異性擴增驢產品的鑒別引物.而通過本實驗的后續(xù)5種常見動物源性引物復篩，其結果皆為陰性擴增，更加說明了所設計的驢引物的特異性.

本實驗中使用熒光PCR對市場中可能存在的偽品阿膠的動物來源做了調研，確定了以豬、牛、羊、馬、驢、兔在內的六種動物作為排查范圍，建立了檢測體系，通過本實驗的研究，說明基于熒光PCR技術上的對阿膠動物源性檢測具有高特異性、高靈敏度，且重復性好、定量準確、自動化程度高、全封閉反應等優(yōu)點，是辨別阿膠真?zhèn)蔚挠行侄?此實驗的開展，也為其他肉類食品的動物來源提供了檢測方案.

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PCR fluorescence detection of common adulterants Ejiao

CHEN Zhi-xuan, GONG Guo-li*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Common PCR reaction system have only one pair of primers,but fluorescent PCR reaction also need to add a fluorescent probe.This study using Real-Time PCR technology to identified donkey donkey-derived ingredients.Extracting the gelatin DNA as a template of PCR system.Use the primers and probes of pig,cattle,sheep,horse,rabbit, donkey for screening, positive results of animal origin shall contain such ingredients.Three different brands of commercially available gelatin using this method,the experimental results is that the pig,cattle,sheep,horse,rabbit were negative,donkey is positive results.Real-Time PCR technique is a method of saving time,and can used in mass detection.

Ejiao; Real-Time PCR; detection

2015-03-17

國家自然科學基金項目(20906058)； 陜西科技大學學術骨干培育計劃項目(XSG2010009)

陳志宣(1989-)，女，陜西咸陽人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥學通訊作者:龔國利(1976-)，男，內蒙古豐鎮(zhèn)人，教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵,84838702@qq.com

1000-5811(2015)03-0135-05

R285

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