朱 彪, 張欣然, 趙 剛, 郭希民, 郭紅延

(北京: 1. 武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心, 100039; 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 100850)

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以ADSCs替代BMMSCs構(gòu)建組織工程骨修復(fù)種植區(qū)骨缺損的實驗研究

朱 彪1, 張欣然1, 趙 剛2, 郭希民2, 郭紅延1

(北京: 1. 武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心, 100039; 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 100850)

目的: 探討以脂肪來源干細胞(ADSCs)構(gòu)建組織工程骨修復(fù)種植體周圍骨缺損的成骨效果。方法：拔除6只 Beagle犬下頜雙側(cè)前磨牙。3個月后，在每側(cè)下頜拔牙區(qū)植入2個種植體，并在每個種植體的遠中制備5 mm×5 mm×5 mm的骨缺損，分別隨機植入ADSCs復(fù)合富血小板血漿(PRP)(ADSCs-PRP)凝膠(n=12)和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)復(fù)合富血小板血漿(BMMSCs-PRP)凝膠(n=12)。移植后1、3個月取材，行大體及組織學(xué)觀察，影像學(xué)方法檢測植骨區(qū)骨密度。結(jié)果： ADSCs組和BMSCs組術(shù)后即刻植骨區(qū)骨密度分別為75±9和77±10(P>0.05)，術(shù)后1個月為102±13和101±9(P>0.05)，術(shù)后3個月為109±14和111±12(P>0.05)。結(jié)論：ADSCs可以作為一種替代的間充質(zhì)譜系來源細胞構(gòu)建組織工程骨修復(fù)種植體周圍骨缺損。

骨髓間充質(zhì)干細胞; 脂肪來源干細胞; 組織工程骨; 口腔種植

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(11):651]

隨著種植學(xué)的發(fā)展，對種植體成功率的要求不斷提高。但種植區(qū)骨量不足，可直接影響種植體的穩(wěn)定性和與骨界面的有效結(jié)合。傳統(tǒng)的植骨材料有其局限性，近年來有學(xué)者將組織工程骨應(yīng)用于修復(fù)種植體周圍骨缺損，取得了一定進展[1-2]。目前構(gòu)建組織工程骨大多以應(yīng)用比較成熟的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)為基礎(chǔ)[2-5]，但BMMSCs在組織中含量極少、體外擴增周期長，隨年齡增長成骨能力逐漸下降[6]，且抽取骨髓創(chuàng)傷大、技術(shù)復(fù)雜[7]，不易被患者所接受。因此有必要驗證一種新組織來源間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在種植體周圍的成骨潛能。脂肪來源干細胞(adipose derived stem cells， ADSCs)具有來源豐富、取材方便、細胞增殖傳代速率快等優(yōu)點。本實驗擬采用ADSCs復(fù)合富血小板血漿(platelet- rich plasma，PRP) (BMMSCs復(fù)合PRP作為對照)構(gòu)建組織工程骨植入到種植體周圍骨缺損區(qū)，評價其成骨效果，為臨床尋找一種更加可行的組織工程材料修復(fù)種植體周圍骨缺損提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

1歲左右Beagle犬6只，體質(zhì)量10～15 kg，雌雄不限(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供, 合格證號: 0020139)。

α- MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(HyClone，美國); 胰酶、β-甘油磷酸鈉、左旋維生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺、牛凝血酶(Sigma，美國)；進口脫鈣液、Masson染色試劑盒(北京中杉金橋)；青、鏈霉素(石家莊華北制藥)；3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo, 美國)；X90-3生物凈化工作臺(北京中化)；SC-3610低速離心機(科大創(chuàng)新股份中佳分公司)；340型酶聯(lián)儀(BDSL，英國)；BX53正置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；RM2016切片機(上海徠卡)；ZPJ-1A展片機、KPJ-1A烤片機(天津天利航空機電)。

1.2 ADSCs和BMMSCs的分離培養(yǎng)

30 g/L戊巴比妥靜脈推注麻醉(1.0 mL/kg)Beagle犬后，無菌條件下切取其腹部脂肪組織，酶消化法獲得細胞懸液；過濾后將液性部分716×g離心5 min，棄上層殘余脂肪及上清液；然后加入含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的α- MEM培養(yǎng)基，輕輕吹打制成細胞懸液后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后首次換液，以后每2 d換液1次。約6 d細胞融合80%左右時進行傳代。

雙側(cè)髂骨抽取骨髓液3 mL，肝素抗凝后全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs：①骨髓液與等體積PBS磷酸鹽緩沖液混勻后716×g離心5 min，棄上清；②5 mL PBS重懸細胞沉淀，716×g離心5 min，棄上清；接種于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；3 d后首次換液，以后每2 d換液1次，約11 d后，細胞長滿瓶底70%～80%，傳代擴增。

1.3 ADSCs和BMMSCs的成骨向分化及其相關(guān)檢測

Von Kossa染色：0.5 g/L胰酶分別消化P2代ADSCs和BMMSCs制成單細胞懸液備用；以每孔6.0×106個細胞的密度分別接種于24孔板(每種細胞設(shè)3個復(fù)孔)，待細胞長滿80%左右時加入成骨誘導(dǎo)液(在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入100 mL/L胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、10 nmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L的左旋維生素C)培養(yǎng)。誘導(dǎo)14 d后分別行Von Kossa染色。染色步驟如下：①輕輕倒去24孔板中培養(yǎng)液，PBS液沖洗2次，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛液固定5 min，雙蒸水沖洗3次；②每孔中加入1 mL 50 g/L AgNO3液，然后將24孔板置于紫外燈下照射1 h；③倒掉AgNO3液，雙蒸水沖洗3次；④每孔加入1 mL Na2S2O3中和殘留的AgNO3液，吸出液體，室溫下晾干封固。

ALP活性檢測：調(diào)整ADSCs和BMMSCs細胞濃度均為1.0×105/ mL，每孔加入50 μL細胞懸液分別接種于96孔板；待細胞融合約80%時換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后第1、3、5、7天對2種細胞行ALP活性定量檢測(每組設(shè)3個復(fù)孔)；吸去培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入1 g/L Triton X-100 30 μL，4 ℃過夜，震蕩后于顯微鏡下觀察已無完整結(jié)構(gòu)；每孔加入ALP緩沖液和基質(zhì)液各 50 μL, 37 ℃孵育30 min后加入ALP顯色液100 μL，用分光光度計檢測各孔520 nm波長處的吸光度值(OD值)。

RT- PCR檢測成骨相關(guān)基因和表達: 使用Trizol試劑盒分別提取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后第3天的ADSCs和BMMSCs細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并擴增，擴增條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。檢測以下成骨相關(guān)基因的表達水平：Ⅰ型膠原(collagen typeI)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)。各引物由上海生工合成，以GAPDH為內(nèi)參，各引物序列見表1。

表1 RT- PCR引物序列

1.4 MTT檢測

分別取P2代ADSCs和BMMSCs單細胞懸液，以每孔1.0×103個細胞密度接種于96孔板中培養(yǎng)，每 2 d更換培養(yǎng)液(接種后第1、2天檢測的實驗孔無需換液)；接種后24 h開始檢測，連續(xù)檢測11 d；實驗孔(6個復(fù)孔)中各加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，于酶聯(lián)免疫檢測儀測定492 nm波長處(以空白孔調(diào)零)吸光度值(OD值)；取每天檢測的吸光度平均值，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制ADSCs和BMMSCs的生長曲線，分析細胞生長規(guī)律。

1.5 血小板計數(shù)與PRP制備

無菌條件下抽取16 mL犬靜脈血于EDTA抗凝真空采血管中，1 mL作血細胞分析計數(shù)全血血小板；15 mL兩步離心法制作PRP：① 402 × g離心10 min，吸取上層血漿(約2.1 mL)，于另一離心管中；②1 610 × g離心10 min，吸棄上層血漿(約1.5 mL)，剩余即為PRP(約0.6 mL)，取10 μL PRP做血細胞分析計數(shù)血小板(需稀釋至1 mL)。

1.6 制備組織工程骨

用 0.5 g/L胰蛋白酶分別消化P2代ADSCs和BMMSCs，258 × g離心5 min，吸棄上層液體留細胞沉淀備用；0.2 mL PRP重懸ADSCs(約5×106個細胞，P3代)，并加入0.1 mL激動劑(1 000 U牛凝血酶溶于1 mL 100 g/L的CaCl2溶液)即制備成組織工程骨A；另取0.2 mL PRP重懸BMMSCs并加入0.1 mL激動劑，制成組織工程骨B。所有制備成的組織工程骨均在10 min內(nèi)植入動物體內(nèi)。

1.7 制備骨缺損模型與植入組織工程骨

微創(chuàng)拔除Beagle犬下頜雙側(cè)4個前磨牙后嚴密縫合，待拔牙創(chuàng)自然愈合；3個月后全麻下全層切開前磨牙區(qū)牙槽頂上的黏骨膜，在大量冰生理鹽水(4 ℃)沖洗降溫下，于雙側(cè)牙槽嵴頂處定點鉆孔，逐級擴孔，雙側(cè)各制備2個種植窩；在每個種植窩的遠中，緊鄰種植窩制備5 mm×5 mm×5 mm的立方體狀骨缺損；植入種植體(SIC，瑞士)，組織工程骨A、B被隨機植入到Beagle犬一側(cè)下頜骨從近中至遠中的骨缺損處，3只Beagle犬分組情況如圖1所示，另外3只犬分組情況相同(術(shù)中采用的MSC和PRP均來自同體犬)；嚴密縫合黏骨膜瓣，拍攝術(shù)后即刻前磨牙區(qū)側(cè)位根尖片。術(shù)后3 d 流質(zhì)飲食，并肌注青霉素100萬單位，2次/d。

▲組織工程骨A植入后1個月取材; ■組織工程骨B植入后1個月取材; △組織工程骨A植入后3個月取材; □組織工程骨B植入后3個月取材

圖1 各只Beagle犬骨缺損區(qū)植入物示意圖

1.8 樣本采集與大體觀察、X線分析和組織學(xué)分析

種植術(shù)后1、3個月分別處死1條Beagle犬。另1條Beagle犬雙側(cè)種植手術(shù)于不同的時間點完成：一側(cè)下頜骨種植手術(shù)后2個月，進行對側(cè)種植手術(shù)，再過1個月處死該犬。另外3條Beagle犬處理情況相同。

截取種植體區(qū)下頜骨標本進行①大體觀察：種植體的穩(wěn)定度，骨缺損區(qū)的組織愈合情況和成骨情況，有無炎癥反應(yīng)等；②拍攝前磨牙區(qū)側(cè)位根尖片(60 kV，2 mA，0.1 s ，PROX，韓國)，盡量使X線發(fā)射球管與下頜骨的近遠中平面垂直。再將根尖片導(dǎo)入Trophy Windows 5.0軟件進行骨密度分析，每張根尖片(種植體周圍的立方體狀骨缺損在根尖片上顯示為正方形狀的二維平面，以根尖片上種植體直徑4 mm為參照，可以定位5 mm×5 mm正方形狀骨缺損對應(yīng)的區(qū)域。將根尖片上正方形狀骨缺損的長和寬均分為5等份，通過這些頂點作平行于正方形各邊的直線，骨缺損區(qū)被成25個晶格。測量正方形平面內(nèi)16個晶格交點的骨密度相對值)重復(fù)測量3次取均值(圖2)。將標本根尖片與對應(yīng)術(shù)后即刻根尖片比較，計算骨密度的變化值。③然后將標本置入40 g/L多聚甲醛中固定48 h后，以近遠中向沿種植體長軸切割組織工程骨修復(fù)區(qū)為頰舌向2部分；機械脫離頰側(cè)骨塊，觀察種植體-骨界面的骨結(jié)合情況；再將頰側(cè)骨塊標本浸入進口脫鈣液中脫鈣48 h(每隔12 h換液1次液)、水洗、脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片后脫蠟、水化、HE染色；同時按Masson染色試劑盒說明行Masson染色(未進行黑核染色)，觀察種植體周圍新骨形成情況。

圖2 骨密度測量示意圖

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ADSCs和BMMSCs生長、增殖情況

ADSCs原代培養(yǎng)24 h后即有細胞貼壁，約6 d細胞融合至80%左右時即可傳代。傳代后細胞增殖迅速，1～2 d即可長滿瓶底，在形態(tài)上與BMMSCs相似；原代培養(yǎng)BMMSCs后第7天，細胞即增殖為集落。細胞形態(tài)似短的成纖維細胞，有長短不同的突起。約6 d后傳代細胞增殖迅速，胞體略增大，以成纖維細胞集落樣方式生長，有形成旋渦的趨勢(圖3)。

ADSCs BMMSCs

圖3 兩組細胞傳代培養(yǎng)的形態(tài)(倒置相差顯微鏡, × 4)

2.2 Von Kossa染色

用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)2組P3代細胞，見細胞分泌基質(zhì)增多。第14天行Von Kossa染色，均可見細胞密集區(qū)域顆粒狀黑染結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)已礦化(圖4)。

ADSCs BMMSCs

圖4 兩組細胞成骨誘導(dǎo)后的Von Kossa染色(倒置相差顯微鏡,×10)

2.3 ALP活性檢測

隨時間推移，兩組細胞的ALP活性均在5 d左右達峰值，7 d時吸光度值回落。第3 天時BMMSCs的ALP活性明顯高于ADSCs(P﹤0.05)(表2)。

表2 2組細胞ALP活性的比較

2.4 RT- PCR檢測相關(guān)成骨基因的表達水平

RT- PCR檢測結(jié)果表明：BMMSCs組細胞成骨相關(guān)基因Col- I的表達水平明顯高于ADSCs組(P﹤0.05)，而OCN和BSP的表達水平在兩組間無顯著性差異(圖5)。

圖5 兩組細胞成骨相關(guān)基因表達水平比較

2.5 MTT檢測與細胞增殖曲線

兩組細胞的生長趨勢均呈“S”型，可以分為3個階段：ADSCs接種后的前5 d，增殖緩慢，從第6天開始，增殖加速，第7天增殖加速最快，第8天達到平臺期，直至第10 天細胞數(shù)量開始減少；BMMSCs第6天增殖速度最快，第9、10天處于平臺期，曲線顯示此階段細胞數(shù)目不斷增加，此后細胞數(shù)量開始減少(圖6)。

圖6 兩組細胞增殖曲線的比較

2.6 PRP中血小板計數(shù)

各實驗組PRP中血小板數(shù)目分別為對應(yīng)全血中血小板數(shù)目的10.13～13.18倍(表3)。

表3 各組PRP中血小板濃縮倍數(shù)

2.7 大體觀察

所有Beagle犬沒有因意外死亡而退出實驗者，種植區(qū)黏膜無紅腫破潰，無膿腫形成等局部炎癥反應(yīng)。所植種植體均無松動、脫落，叩診聲音清脆。組織工程骨修復(fù)區(qū)未見明顯的免疫排斥反應(yīng)。

2.8 組織學(xué)觀察

1個月時，Masson染色中骨缺損區(qū)充填有大量的膠原纖維結(jié)締組織(膠原纖維等纖維結(jié)締組織呈藍色)，大量不規(guī)則的骨髓腔，新骨間可見新生的毛細血管和少量尚未鈣化、不成熟的類骨質(zhì)(類骨質(zhì)、角質(zhì)等組織呈紅色)，以ADSCs為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨的修復(fù)區(qū)可見較多的膠原纖維(圖7a、b)。以BMMSCs為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨的修復(fù)區(qū)可見較多不規(guī)則骨髓腔和毛細血管網(wǎng)(圖8a、b)。HE染色中兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)均未見淋巴細胞灶性浸潤(圖7～8c、d)

3個月時，Masson染色顯示新生骨量明顯增加，新生骨致密且成熟，骨小梁粗大但排列紊亂，形成或者有趨勢形成Haversian系統(tǒng)，纖維結(jié)締組織明顯減少，骨髓腔數(shù)量減少、直徑變小。兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)修復(fù)效果差異不大，與種植體呈骨性結(jié)合(圖9～10a、b)。HE染色中兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)可見成排的成骨細胞排列，未見淋巴細胞灶性浸潤(圖9～10 c、d)。

a．Masson染色(×4) b．Masson染色(×10) c．HE染色(×4) d．HE染色(×10)

圖7 移植1個月后ADSCs組織工程骨修復(fù)區(qū)組織切片(倒置相差顯微鏡)

a．Masson染色(×4)b．Masson染色(×10) c．HE染色(×4) d．HE染色(×10)

圖8 移植1個月后BMMSCs組織工程骨修復(fù)區(qū)的組織切片(倒置相差顯微鏡)

a．Masson染色(×4)b．Masson染色(×10)c．HE染色(×4)d．HE染色(×10)

圖9 移植3個月后ADSCs組織工程骨修復(fù)區(qū)組織切片(倒置相差顯微鏡)

a．Masson染色(×4)b．Masson染色(×10)c．HE染色(×4)d．HE染色(×10)

圖7～10中倍放大圖片中黑色直線為組織工程修復(fù)區(qū)和正常組織的分界線，分界線的下方為組織工程骨修復(fù)區(qū)；黑色箭頭示種植體所在部位；10倍圖片為對應(yīng)4倍圖片矩形圖框內(nèi)的放大圖像

圖10 移植3個月后BMMSCs組織工程骨修復(fù)區(qū)的組織切片(倒置相差顯微鏡)

2.9 骨密度分析

單因素方差分析顯示，兩種組織工程骨植入后即刻骨密度值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表4); 植入后1、3個月, 兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)骨密度增加值、無統(tǒng)計學(xué)差異(表5)。

表4 兩種組織工程骨修復(fù)骨缺損區(qū)骨密度值

表5 兩種組織工程骨修復(fù)骨缺損區(qū)骨密度變化值

3 討論

種植修復(fù)已成為牙列缺損或缺失患者首選的治療手段，但要保證種植治療遠期成功，前提是種植區(qū)骨量充足[8]; 當種植區(qū)骨量不足、密度欠佳時，種植義齒成功率將受到極大影響。相當多的患者由于牙槽骨吸收、創(chuàng)傷和腫瘤等原因?qū)е戮植抗橇坎蛔愣粷M足種植修復(fù)的適應(yīng)證。自體骨、同種異體骨和無細胞生物衍生材料都曾作為移植物修復(fù)種植體周圍骨缺損[9]，但因為自身各種缺點而限制了其臨床應(yīng)用。植入以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨可能更利于與種植體發(fā)生骨結(jié)合：①種植體植入后，成骨細胞首先遷移到種植體表面，粘附、聚集、分泌骨基質(zhì)，啟動新骨生成。組織工程骨負載高密度具有骨向分化潛能的MSC，有望快速遷移促進早期成骨; ②骨缺損的形態(tài)不規(guī)則，為使組織工程骨與種植體緊密結(jié)合，支架材料的選擇十分重要。本實驗中選用的PRP可塑性良好，可增加骨-種植體界面的結(jié)合率; ③BMP- 2等成骨生長因子，能促進早期骨-種植體界面的骨生長，明顯提高種植體周圍骨結(jié)合的速率[10]。本實驗中選用的PRP包含BMP- 2在內(nèi)的多種生長因子。不同于傳統(tǒng)的植骨修復(fù)，以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨對于種植體發(fā)生骨結(jié)合有促進作用，種植體也會影響骨缺損區(qū)組織工程骨的修復(fù)。種植體位于骨缺損區(qū)的一個側(cè)壁，它部分中斷了組織工程材料的骨傳導(dǎo)性，這樣組織工程材料的骨誘導(dǎo)性就顯得尤為重要。本研究中，PRP中包含的血小板來源的生長因子是否起了重要的骨誘導(dǎo)作用，這還有待于進一步研究。

間充質(zhì)干細胞是組織工程骨移植獲得骨再生的基礎(chǔ)。BMMSCs于1966年首次成功鑒定，作為一種間充質(zhì)譜系細胞具有骨向分化的能力已廣為熟知，它能促進包括種植體周圍骨缺損在內(nèi)的不同類型骨缺損區(qū)骨再生[5，11-13]。但是BMMSCs用于臨床必須行骨髓穿刺，給患者帶來較大痛苦，因此限制了其臨床應(yīng)用。臨床上迫切需要尋求一種替代組織來源的MSC行使BMMSCs的功能。ADSCs是2001年首次從人脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，具有類似于BMMSCs的生物學(xué)特性和骨向分化潛能[14]。近年來隨著肥胖人群的增多，吸脂手術(shù)廣泛開展，可為ADSCs提供充足來源。而且脂肪組織容易再生，還可以反復(fù)進行吸脂術(shù)。本結(jié)果也顯示，ADSCs首次傳代時間短，并且傳代后在形態(tài)上與BMMSCs差別不大，MTT結(jié)果顯示其可較早進入細胞增殖平臺期，這奠定了ADSCs作為一種替代間充質(zhì)譜系種子細胞的基礎(chǔ)。雖然ADSCs的體外成骨能力已被許多實驗證實[15-16]，但本實驗側(cè)重于ADSCs和BMMSCs體外、體內(nèi)原位成骨能力的比較，而這種比較對于ADSC作為替代組織來源的種子細胞構(gòu)建組織工程骨修復(fù)種植體周圍骨缺損至關(guān)重要。

表達ALP、合成I型膠原、骨鈣素等骨基質(zhì)蛋白、體外可以形成礦化結(jié)節(jié)等特征已被作為鑒定成骨細胞的經(jīng)典標準。本實驗中ADSC與BMMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，Von Kossa染色均顯示有鈣結(jié)節(jié)形成，ALP定量顯示均有ALP表達，表明兩種細胞均能在體外被誘導(dǎo)為成骨細胞。為進一步觀察兩種間充質(zhì)譜系細胞的體外成骨能力，本實驗選取Col- I、OCN和BSP 三種骨向分化相關(guān)的特異性基因作為檢測指標。Col- I是早期骨向分化的標志，干細胞向成骨細胞分化一般均出現(xiàn)Col- I的表達。OCN是骨組織中含量最豐富的非膠原蛋白，能與礦物質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)于成骨分化晚期，標志著細胞開始進入礦化期。BSP能與膠原纖維結(jié)合形成局部高濃度的鈣，導(dǎo)致礦物質(zhì)沉積，也是檢驗成骨細胞分化的特異性指標之一。本結(jié)果顯示，兩種細胞均有Col- I、OCN和BSP的陽性表達，提示ADSCs有很強的體外成骨能力。但在成骨誘導(dǎo)后第3天，BMMSCs的ALP活性、Col- I表達量均顯著高于ADSCs，這可能是因為BMMSCs在成骨誘導(dǎo)時比ADSCs具有同向優(yōu)越性：BMMSCs更容易向成骨細胞誘導(dǎo)分化，而ADSCs易向脂肪細胞分化[17]，但這并不影響ADSCs選作組織工程骨的種子細胞的可行性。Niemeyer[18]等在綿羊脛骨缺損的模型中比較了ADSCs和BMMSCs的成骨潛能，雖然ADSCs的成骨潛能弱于BMMSCs，但可通過加入PRP進行補償。

組織工程骨一般包括向成骨方向誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細胞、具有引導(dǎo)成骨作用的支架材料和具有誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)作用的生長因子[19]。其構(gòu)建策略主要包括以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨構(gòu)建和無細胞的組織工程骨構(gòu)建[20]，后者是以具有骨誘導(dǎo)活性的生長因子為基礎(chǔ)構(gòu)建，它可以誘導(dǎo)骨缺損周圍機體自身的干細胞分化為成骨細胞，進而產(chǎn)生修復(fù)作用。以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨的修復(fù)效果優(yōu)于空白對照和具有骨傳導(dǎo)性和(或)骨誘導(dǎo)性的生物衍生材料或生物活性材料，這已被國內(nèi)外很多研究所證實[1，2，9，16，18]。而本實驗側(cè)重于比較以不同譜系的間充質(zhì)干細胞為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨的修復(fù)效果。間充質(zhì)干細胞的分化方向因機體發(fā)育的需要和它們所處的微環(huán)境(干細胞龕)而定，要真正評價以細胞為基礎(chǔ)的組織工程骨成骨能力，需要將其原位植入體內(nèi)。本實驗以兩種間充質(zhì)干細胞為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程骨，將其植入到犬種植體周圍骨缺損區(qū)，成骨效果相似：兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)骨密度值均隨時間不斷升高；且在1、3個月時，骨密度值均無統(tǒng)計學(xué)差異；兩種組織工程骨修復(fù)區(qū)均能與種植體形成骨結(jié)合。但1個月時BMMSCs組織工程骨修復(fù)區(qū)似乎比ADSCs骨修復(fù)區(qū)形成有更多的骨髓腔，這可能是因為在某種程度上BMMSCs能夠通過旁分泌作用創(chuàng)造有利于組織再生的微環(huán)境，尤其能夠促進骨髓造血組織的形成[21]。

BMMSCs具有低免疫原性和較低的抗原提呈能力。Tse等[22]將BMMSCs與異基因外周血單個核細胞或同種異體T淋巴淋巴細胞共培養(yǎng)后不能引起T淋巴淋巴細胞的顯著增殖。BMMSCs不表達MHC- Ⅱ類分子和FasL，不表達B7- 1、B7-2，低水平表達或者不表達MHC- I類分子、CD40和CD40L。本實驗中，兩種組織工程修復(fù)區(qū)在大體觀察時均未見明顯的免疫排斥反應(yīng)，組織學(xué)觀察也未見淋巴細胞灶性浸潤，提示ADSCs與BMMSCs一樣具有免疫豁免性。

綜上所述，盡管ADSCs和BMMSCs的生物學(xué)特性和成骨潛能存在著細微差別，但是ADSCs仍可以作為一種替代間充質(zhì)譜系細胞構(gòu)建組織工程修復(fù)種植體周圍骨量不足。

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Adipose derived stem cells as an alternative to bone marrow mesenchymal stem cells in tissue- engineeried bone for repairing bone defect in dental implant region: an experimental study

ZHU Biao*, ZHANG Xin- ran, ZHAO Gang, GUO Xi- min, GUO Hong- yan

(*StomatologyCenter,GeneralHospitalofArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

AIM: To study the osteogenesis potential of tissue- engineered bone with adipose derived stem cells(ADSCs)for repairing bone defect in dental implant region. METHODS: Bilateral premolars were extracted in 6 Beagle dogs. 3 months later，2 implants were respectively implanted in each side of the mandibular，and a 5 mm×5 mm× 5 mm size bone defect was created in the distal area of each implant. ADSCs-platelet rich plasma (ADSCs- PRP) composite gel (n=12) and bone marrow mecenchymal stem cells-platelet rich plasma (BMMSCs-PRP) composite gel (n=12) were respectively applied into the defects. 1 and 3 months after transplation, gross investigation and histological observation were made. The bone density at the grafting area was measured by topographic technic. RESULTS: Immediately after implantation the bone density of ADSCs group and BMMSCs group was 75±9 and 77±10(P>0.05), 1 mouth after implantation 102±13 and 101±9(P>0.05), 3 months after implantation 109±14 and 111±12(P>0.05), respectively. CONCLUSION: ADSCs can be a alternative cell source for tissue- engineered bone for repairing bone defect in dental implant region.

bone marrow mesenchymal stem cells; adipose derived stem cells; tissue- engineered bones; oral implantology

2015-07-04;

2015-09-24

朱彪(1986-)，男，漢族，河北衡水人。碩士生(導(dǎo)師：郭紅延)

郭希民，E-mail: guoxim@163.com; 郭紅延，E-mail: ghyfmmu@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)11-0651-08

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.11.003