劉 里， 成飛翔

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

呋塞米與牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金屬離子的影響

劉 里， 成飛翔

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

利用紫外和熒光技術(shù)研究了在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，呋塞米與牛血清白蛋白(BSA)相互作用及常見(jiàn)金屬離子對(duì) BSA-呋塞米體系的影響.結(jié)果表明Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+對(duì)呋塞米與BSA的結(jié)合有明顯競(jìng)爭(zhēng)作用.發(fā)現(xiàn)呋塞米對(duì)BSA有較強(qiáng)的熒光猝滅作用，測(cè)定了該反應(yīng)的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合位置.根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了該藥物與BSA之間的作用力類型，兩者之間的作用力類型主要為范德華力和氫鍵.呋塞米在BSA中的結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA.Hill系數(shù)約等于1，表明呋塞米對(duì)結(jié)合作用幾乎無(wú)協(xié)同作用.同時(shí)應(yīng)用同步熒光技術(shù)研究了呋塞米對(duì)BSA構(gòu)象的影響.

呋塞米;牛血清白蛋白;相互作用;金屬離子

呋塞米具有利尿、擴(kuò)張血管的藥理作用.臨床上用于治療水腫、高血壓、急性肺水腫和腦水腫[1].目前，分子光譜法研究藥物分子與血清白蛋白(BSA)的相互作用已有報(bào)道[2-4]，但呋塞米與BSA 相互作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)理上，而本文除了采用兩種分子光譜法研究了呋塞米與BSA之間的作用機(jī)理及結(jié)合特征，還深入探討了兩者的結(jié)合位置、藥物之間的協(xié)同性以及金屬離子對(duì)呋塞米與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響，這些比較深入的研究對(duì)于更全面的了解藥物在體內(nèi)與血清白蛋白的結(jié)合情況及金屬離子對(duì)反應(yīng)的影響具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 所用儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，Cary 50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司)，精密酸度計(jì)：pHS-3C，上海虹益儀器儀表有限公司，超級(jí)恒溫水浴鍋(DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司).BSA配制成濃度為1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，呋塞米(中國(guó)藥品生物制品檢定所)配制成濃度為1.2094×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，這兩者藥品都需在4 ℃的冰箱中保存.其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10.0mL容量瓶中依次加入0.5mol·L-1NaCl溶液2.0mL以保持反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度；0.2mol·L-1，pH=7.4的K2HPO4-檸檬酸緩沖溶液2.0mL；1.0×10-5mol/L的BSA 1.5mL和不同體積的1.2094×10-4mol·L-1的呋塞米溶液，定容至10mL，靜置5min后進(jìn)行熒光測(cè)定.激發(fā)光波長(zhǎng)280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm.熒光分光光度計(jì)記錄熒光光譜，于1cm石英池中分別測(cè)量F0和F(F和F0分別指呋塞米存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度).

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別考察了緩沖溶液、pH值、緩沖溶液的用量、BSA的濃度、試劑加入順序以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，選用0.02mol/L，pH=7.40的K2HPO4-檸檬酸緩沖溶液2mL調(diào)節(jié)酸度，1.5×10-6mol/L BSA作為反應(yīng)濃度，NaCl→K2HPO4-檸檬酸→BSA→呋塞米的加入順序，放置5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量.

2.2 熒光光譜

在實(shí)驗(yàn)條件下，呋塞米沒(méi)有熒光的，而B(niǎo)SA有較強(qiáng)的熒光，并在λex/λem=280/340nm處.當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí)，呋塞米-BSA在346nm處有一最大熒光峰，隨著藥物濃度的不斷增加，熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低，如圖1所示.熒光光譜結(jié)果表明BSA與呋塞米可能發(fā)生了相互作用.

2.3 呋塞米對(duì)BSA的猝滅機(jī)制

熒光猝滅機(jī)理分動(dòng)態(tài)和靜態(tài)二種[5]，它們都符合Stem-Volmer方程[6]，即：F0/F=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]，式中：Kq為速率常數(shù)；Ksv為猝滅常數(shù)；[L]為呋塞米的濃度.不同溫度下，以F0/F與[L]作圖，得到的Kq、Ksv及相關(guān)系數(shù)r(表1).與擴(kuò)散有關(guān)的，溫度增加將使Ksv變大的是動(dòng)態(tài)猝滅；而靜態(tài)猝滅時(shí)，溫度升高導(dǎo)致配合物穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致Ksv減小.因此，可利用Ksv隨溫度的變化情況來(lái)判別猝滅機(jī)理[6].由表1可見(jiàn)，升高溫度，Ksv降低，推測(cè)是靜態(tài)猝滅過(guò)程.

表1 三個(gè)溫度下呋塞米對(duì)BSA的猝滅常數(shù)Tab.1 Quenching constant at three temperatures

若猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅，更應(yīng)符合L-B方程[7]：(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[L])-1，式中KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù).根據(jù)L-B方程計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2.從表2可以看出，三個(gè)溫度下的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.99以上，其KLB值都在104數(shù)量級(jí)，表明呋塞米與BSA的作用符合靜態(tài)猝滅的特征.

對(duì)于靜態(tài)猝滅，由于在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的配合物，從而引起B(yǎng)SA紫外吸收光譜的變化[6].而動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜[6].因此可通過(guò)紫外光譜來(lái)確定呋塞米對(duì)BSA的猝滅類型.圖2為加入呋塞米前后BSA紫外光譜的變化對(duì)比圖.從圖2可以看出，相比較于BSA(1) 、呋塞米(2) 疊加后的吸收光譜(3) ，加入呋塞米后 BSA的吸收光譜(4)峰的位置(移動(dòng)5nm)和強(qiáng)度(減弱了三分之一)發(fā)生了明顯變化，因此，進(jìn)一步證明呋塞米對(duì)BSA熒光的猝滅過(guò)程是由靜態(tài)猝滅引起的.

2.4 結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)n

假設(shè)探針小分子L與生物大分子B存在n 個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，L與B之間相互作用關(guān)系即熒光強(qiáng)度與猝滅劑可用雙對(duì)數(shù)方程:lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[L]進(jìn)行描述[2-4]，分別在292K、307K、322K溫度下繪制呋塞米與BSA的lg(F0-F)/F-lg[L]的雙對(duì)數(shù)可得到一條直線.根據(jù)截距和斜率求得相應(yīng)的Kb和n，見(jiàn)表3.由表3可看出，線性良好，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，表明呋塞米與BSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)； Kb為較大，表明呋塞米與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存.

表2 L-B線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)Tab.2 Correlative parameters of the linear regression equations of L-B plots

表3 結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTab.3 The apparent binding constants (Kb) and the binding sites(n)

2.5 熱力學(xué)參數(shù)及作用力

判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型，按照文獻(xiàn)[7]的方法計(jì)算292K、307K、322K溫度下自由能變?chǔ)、熵變?chǔ)以及焓變?chǔ)的大??；計(jì)算結(jié)果如表4所示.依據(jù)Ross等[8]的判斷規(guī)則，ΔH<0，ΔS<0判斷出BSA與呋塞米之間的作用力是氫鍵和范德華力；ΔH<0表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)，ΔG越小越有利于反應(yīng)的進(jìn)行.

表4 熱力學(xué)參數(shù)值Tab.4 Thermodynamic parameters

2.6 結(jié)合位置的確定

BSA是由二硫鍵連接起來(lái)的幾個(gè)螺旋狀區(qū)域所組成的[2].藥物與BSA結(jié)合位點(diǎn)分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ.位點(diǎn)Ⅰ位于亞螺旋域ⅡA，而位點(diǎn)Ⅱ和Ⅲ位于亞螺旋域ⅢA的疏水腔中[2].在激發(fā)波長(zhǎng)中，BSA的色氨酸和酪氨酸殘基的熒光能夠同時(shí)激發(fā)的發(fā)波長(zhǎng)為280nm，在這一波長(zhǎng)上兩氨基酸都能同時(shí)被激發(fā)；而激發(fā)波長(zhǎng)為295nm時(shí)，只激發(fā)BSA的色氨酸殘基的熒光[2].由圖3可知，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm和295nm時(shí)，呋塞米對(duì)BSA的猝滅曲線沒(méi)有重疊，且在280nm時(shí)的蛋白熒光猝滅比295nm時(shí)的猝滅程度大，表明在呋塞米與BSA的反應(yīng)中色氨酸和酪氨酸殘基都參與了作用.因此可以判定，呋塞米與BSA的結(jié)合位點(diǎn)是主要位于亞螺旋域ⅡA.

2.7 藥物的協(xié)同性

BSA具有多重結(jié)合部位，藥物與BSA結(jié)合時(shí)，BSA各結(jié)合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用[2-4]，可用Hill方程[2-4]進(jìn)行分析.按照文獻(xiàn)[2-4]的方法計(jì)算呋塞米-BSA的 nH值，列于表5中.表5中，三個(gè)溫度下nH約等于1，表示呋塞米與BSA結(jié)合后，不影響后繼呋塞米與BSA的結(jié)合，即呋塞米間無(wú)協(xié)同性，這時(shí)每一個(gè)呋塞米與BSA的結(jié)合過(guò)程以獨(dú)立的方式進(jìn)行.

2.8 呋塞米對(duì)BSA構(gòu)象的影響

固定BSA，逐步改變呋塞米的濃度，分別在Δλ=15nm和Δλ=60nm，測(cè)得BSA中酪氨酸殘基的同步熒光光譜見(jiàn)圖4(a)和色氨酸殘基的同步熒光光譜見(jiàn)圖4(b).由圖可知，由于探針小分子呋塞米與BSA 的結(jié)合，導(dǎo)致BSA的色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波移動(dòng)，說(shuō)明探針小分子加入引起了BSA 構(gòu)象的變化.

表5 三個(gè)溫度下體系的nHTab. 5 nH of systems at three temperatures

3 金屬離子的影響

金屬離子的存在會(huì)影響藥物與白蛋白的結(jié)合能力，即影響藥物與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)[2-4].從表6可知，在Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+的存在下呋塞米與BSA間的Kb'及n均有不同程度的減小，說(shuō)明金屬離子參與了呋塞米與BSA的結(jié)合過(guò)程.由于 BSA 可與許多金屬離子發(fā)生作用，各種金屬離子與 BSA 的結(jié)合部位不同，結(jié)合力也有差別，所以Kb減小的程度各不相同.因此金屬離子對(duì)于呋塞米與BSA之間作用的影響，主要是由于金屬離子與BSA之間的作用，產(chǎn)生間接競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，導(dǎo)致藥物分子與BSA之間的作用力降低，從面影響藥物分子的治療作用.

表6 金屬離子對(duì)呋塞米與BSA結(jié)合的影響Tab. 6 The influence of Metal ions on Furosemide with BSA

4 結(jié)論

用熒光光譜法和紫外-可見(jiàn)吸收光譜法研究了呋塞米和BSA的結(jié)合作用.研究表明：呋塞米與BSA形成復(fù)合物，從而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，該過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程.計(jì)算了不同溫度下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)，確定了結(jié)合位置在BSA的亞螺旋域ⅡA 中.熱力學(xué)參數(shù)表明兩者結(jié)合時(shí)可能是氫鍵和范德華力起主要作用.同步熒光光譜表明加入呋塞米后BSA構(gòu)型的變化.在結(jié)合過(guò)程中，呋塞米之間無(wú)協(xié)同作用.金屬離子的存在對(duì)兩者的結(jié)合產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)作用.

[1] 楊阿喜.呋塞米的電化學(xué)性質(zhì)及伏安法測(cè)定[J].藥物分析雜志, 2010,30(5):915.

[2] 劉保生,王晶,薛春麗,等.頭孢噻肟鈉和氯霉素與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析[J].發(fā)光學(xué)報(bào),2011,32(6):630-631.

[3] SULKOWSK A, BOJKO B, ROWNICKA J， et al. Paracetamol and cytarabine binding competition in high affinity binding sites of transporting protein[J]. J Mol Struct, 2006,27(12):249-256.

[4] 劉保生,楊超,王晶,等.硫酸頭孢匹羅與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)的發(fā)光機(jī)理[J].發(fā)光學(xué)報(bào),2011,32(3):295-296.

[5] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy 3rd ed[M]. Springer Press, New York, 2006,280.

[6] 許金鉤，王尊本.熒光分析法(第三版)[M].北京:科學(xué)出版社,2006:67-79.

[7] 劉里,彭洪生,伏云紅.熒光光譜法研究頭孢孟多酯與牛血清白蛋白的相互作用[J].中國(guó)測(cè)試,2014,40(3):65.

[8] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochem, 1981,20(11):3096.

Study on the Interaction Between Furosemide with Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction

LIU li， CHENG fei-xiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University，Qujing 655011，China)

The interaction between Furosemide and bovine serum albumin (BSA) was studied under the optimal conditions by ultraviolet and fluorescent technique. The effect of common metal ions on the BSA-Furosemide system was also researched．Results show that Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+have obvious competitive effect on the binding． It is shown that Furosemide has a powerful ability to quench the fluorescence of BSA. The reaction of apparent binding constant, binding points, and combined with location were determined. According to the thermodynamic parameters, thermodynamic parameters were obtained, which indicated that the action force was mainly van der Waals force and hydrogen bonds. The primary binding site for Furosemide was located at sub-domain ⅡA of BSA. The values of Hill's coefficients were nearly 1, which indicated that there was nearly no cooperative effect. In addition, the effect of Furosemide on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectroscopy.

furosemide; bovine serum albumin; interaction; metal ions

10.14182/J.cnki.1001-2443.2015.05.009

2014-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21261019)；云南省教育廳科研項(xiàng)目(2015C090Y).

劉里(1982-)，女，滿，吉林省吉林市人，講師，主要從事藥物化學(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用研究.

劉里，成飛翔.呋塞米與牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金屬離子的影響[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，38(5)：450-454.

O657.3

A

1001-2443(2015)05-0450-05