沈建英 丁珊珊 賴新梅 楊小婷 柯龍 林開敏 楊敏

圍絕經(jīng)期綜合征指婦女絕經(jīng)前后由于性激素波動或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀，其中雌激素水平下降是引起該病的主要原因[1-2]。隨著生活水平提高，工作壓力加大，人口老齡化加劇，圍絕經(jīng)期綜合征的發(fā)病率逐年增高。肝氣郁結(jié)證是其主要中醫(yī)證型，中醫(yī)藥治療已經(jīng)取得較好的療效，而且副作用小[3-4]。目前比較認(rèn)可的圍絕經(jīng)期綜合征肝郁模型是運(yùn)用自然衰老的大鼠進(jìn)行造模，然而由于其飼養(yǎng)周期長，成本高，來源非常稀少，因此相關(guān)的研究報(bào)道相對較少，中醫(yī)藥對其作用機(jī)制的了解受到很大的局限[5-6]。而去勢大鼠也是公認(rèn)的圍絕經(jīng)期綜合征模型，其陰道脫落細(xì)胞涂片及血清性激素水平均和圍絕經(jīng)期發(fā)生的改變相似[7-8]。因此本研究擬用去勢大鼠模型，聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激與孤養(yǎng)法進(jìn)行造模，從外觀特征及行為學(xué)水平來探討該模型的有效性，為進(jìn)一步探討中醫(yī)藥治療圍絕經(jīng)期綜合征肝郁的科學(xué)內(nèi)涵提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量（220±20）g，清潔級，動物許可證號為SCXK （京） 2002-2009，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。光/暗周期為12 h/12 h（光照時(shí)間6：00-18：00），室溫（22±2）℃，相對濕度保持為30%~40%，喂常規(guī)顆粒飼料及飲用水。適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，利用敞箱實(shí)驗(yàn)對每只大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動總得分低于40分和高于160分的動物予以剔除，選擇各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)得分相近的24只大鼠，按體質(zhì)量分層采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢空白組、去勢模型組，每組各8只，組間體質(zhì)量及曠場評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

1.2 模型的建立 （1）去勢：動物分組后行去卵巢手術(shù)。手術(shù)前，兩組大鼠均禁食12 h，按體質(zhì)量腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，模型組從腹部正中線切口，切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組不切除卵巢，只將卵巢旁與卵巢等大的一塊脂肪組織切除。動物手術(shù)后自然修復(fù)兩周，在慢性束縛應(yīng)激前進(jìn)行連續(xù)5 d陰道涂片檢測，觀察無成熟脫落細(xì)胞，證明卵巢切除完整，造模成功。假手術(shù)組動物的陰道脫落細(xì)胞依然呈典型的周期性變化。（2）慢性束縛：用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝郁證大鼠模型，將去勢模型組大鼠置于束縛筒內(nèi)，管壁有若干通風(fēng)口，通風(fēng)良好，大鼠能夠自由呼吸，束縛應(yīng)激時(shí)間為6 h（9：00-15：00），連續(xù)束縛21 d，束縛應(yīng)激期間禁食禁水。假手術(shù)組和去勢空白組在同一時(shí)段內(nèi)也是禁食禁水。（3）孤養(yǎng)：去勢模型組單籠飼養(yǎng)，假手術(shù)組和去勢空白組群養(yǎng)，4只/籠。

1.3 體質(zhì)量與行為學(xué)檢測

1.3.1 外部特征及體質(zhì)量 每天造模前觀察并記錄各組大鼠的飲食、二便、毛發(fā)色澤、情緒行為等外觀方面的變化。分別于手術(shù)前1天，應(yīng)激前1天，應(yīng)激第7、14、21天上午8：00-9：00記錄各組大鼠體質(zhì)量。

1.3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 于動物分組前、應(yīng)激前1天和應(yīng)激第21天8：00-12：00進(jìn)行測試。采用自制長×寬×高=75 cm×75 cm×40 cm的敞箱，底面劃分成25個(gè)面積相等的方格。曠場的中央放一彩色瓶子激發(fā)大鼠的好奇心。拍攝并記錄5 min內(nèi)大鼠的水平運(yùn)動格數(shù)（四爪皆進(jìn)入記為1分）和垂直豎立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附箱壁記為1分）。每只大鼠均從同一角落放入，測評結(jié)束后，及時(shí)記錄糞便顆粒數(shù)，并用75%酒精擦拭以消除氣味的影響，待酒精晾干后再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 分別在分組前、造模前和造模結(jié)束后檢測各組大鼠的糖水消耗率。按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行部分修改，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，每只大鼠單籠喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前，訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)含糖飲水12 h（20：00-次日8：00），10 h禁食禁水后，同時(shí)給予1%蔗糖水和純水各1瓶，1 h后調(diào)換蔗糖水和純水的位置，2 h后分別稱量純水消耗量及蔗糖水消耗量，計(jì)算糖水消耗率（糖水消耗率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，對所得一般性數(shù)據(jù)做正態(tài)分布檢驗(yàn)和組間方差齊性檢驗(yàn)，其中體質(zhì)量、糖水消耗率、曠場實(shí)驗(yàn)的水平得分及垂直得分符合正態(tài)分布和方差齊性，用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行分析；曠場實(shí)驗(yàn)中的修飾得分、糞便數(shù)目不符合正態(tài)分布則采用采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外部特征及體質(zhì)量變化比較 造模前，各組大鼠活潑好動，皮毛光澤好、糞便呈球形。造模結(jié)束后，大鼠毛發(fā)變得干枯、胡須下搭、行動遲緩、精神倦怠、嗜臥、進(jìn)食進(jìn)水量減少、大便稀軟。各組大鼠在行去勢手術(shù)前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。去勢后兩周即應(yīng)激前1天，與假手術(shù)組相比，兩個(gè)去勢組的大鼠體質(zhì)量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。于應(yīng)激第7、14、21天，和去勢空白組相比，去勢模型組的體質(zhì)量均顯著下降，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；應(yīng)激第21天，去勢模型組的體質(zhì)量甚至低于假手術(shù)組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表 1。

2.2 三組對曠場行為的影響比較 手術(shù)前，各組大鼠在基線水平的水平得分和垂直得分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；手術(shù)后兩周，即應(yīng)激造模前1天，和假手術(shù)組比較，去勢空白組和去勢模型組大鼠的水平活動得分均有顯著下降（P<0.01）；應(yīng)激造模結(jié)束后，與假手術(shù)組相比，去勢空白組和去勢模型組大鼠的水平活動得分均進(jìn)一步顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在垂直得分的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，僅去勢模型組大鼠在應(yīng)激結(jié)束后，其得分和假手術(shù)組及去勢空白組相比發(fā)生顯著性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。各組大鼠的修飾次數(shù)和糞便顆粒經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但是去勢模型組的修飾次數(shù)有減少的趨勢，糞便顆粒數(shù)有增加的趨勢（數(shù)據(jù)未列出）。

表1 慢性束縛應(yīng)激對各組大鼠體質(zhì)量的影響（x-±s） g

表2 慢性束縛應(yīng)激對各組大鼠曠場行為的影響比較（x-±s） 分

2.3 各組對糖水偏好的影響比較 手術(shù)前，各組大鼠在基線水平的糖水消耗率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；手術(shù)兩周后，即應(yīng)激造模前，和假手術(shù)組比較，去勢空白組和去勢模型組的糖水消耗率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；應(yīng)激造模結(jié)束后，和假手術(shù)組相比，去勢空白組與去勢模型組糖水消耗率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），去勢模型組的糖水消耗率顯著低于去勢空白組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3。

表3 慢性束縛應(yīng)激對各組大鼠糖水偏愛率的影響（x-±s）%

與假手術(shù)組比較，*P<0.01，**P<0.05；△與去勢空白組比較，P<0.01

3 討論

課題組前期研究結(jié)果表明，肝郁是圍絕經(jīng)期綜合征的重要病理因素[4]。圍絕經(jīng)期女性常面臨家庭及事業(yè)等多種問題，精神壓力較大，多感所愿不遂、抑郁于內(nèi)，易形成心理應(yīng)激。因此，建立圍絕經(jīng)期綜合征肝郁動物模型對于本病機(jī)理的深入研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本文通過手術(shù)摘除卵巢人為地造成雌激素突然下降模擬圍絕經(jīng)期綜合征的狀態(tài)，該方法周期短、簡單易行，是常用的一種圍絕經(jīng)期綜合征造模方法[8]。目前普遍認(rèn)為，肝郁多表現(xiàn)為認(rèn)知、人格等心境障礙，病理反應(yīng)涉及植物神經(jīng)功能紊亂，神經(jīng)內(nèi)分泌免疫等調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的失衡[10]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝主疏泄的功能與心理—應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，從心理—應(yīng)激反應(yīng)來研究肝郁是近幾年的研究熱點(diǎn)[11-12]。慢性束縛應(yīng)激使動物自由行動受限，情緒受抑，比較接近中醫(yī)“情志不遂”致郁的發(fā)病學(xué)說；孤養(yǎng)則模擬了人類遠(yuǎn)離社會、家庭的生存狀態(tài)，運(yùn)用束縛制動聯(lián)合孤養(yǎng)法建立肝郁大鼠模型，可以制造較為純粹的挫折應(yīng)激和孤獨(dú)感受，是較好的負(fù)性心理應(yīng)激動物模型[13-14]。另外，因其軀體應(yīng)激因素較小，對機(jī)體無損傷性刺激，與人類身心性疾病的致病過程類似，近年來在肝郁相關(guān)研究中已被廣泛采用[15-16]。本研究表明，去勢模型組大鼠體重增加緩慢，探究行為減少，表現(xiàn)出情緒低落、興趣減退等癥狀，與圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的形成過程相似。

圍絕經(jīng)期女性由于卵巢萎縮，雌激素分泌下降，糖和脂肪代謝發(fā)生紊亂，體脂分布異常，特別是腹內(nèi)脂肪積聚[14]。在本研究中大鼠在去勢手術(shù)后兩周體質(zhì)量顯著增加，該現(xiàn)象與女性在圍絕經(jīng)期的體質(zhì)量變化相吻合。在束縛應(yīng)激條件下，腎上腺皮質(zhì)醇顯著升高，機(jī)體對胰島素的敏感性增加，皮質(zhì)醇還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，抑制其合成，同時(shí)影響糖和脂類的代謝[17]。因此本研究中去勢模型組在應(yīng)激開始后，體質(zhì)量幾乎沒有增長，甚至有下降的趨勢。

在行為學(xué)研究中，曠場實(shí)驗(yàn)可以用來檢測動物在新奇環(huán)境中的活動度、探究行為、恐懼緊張狀態(tài)及警覺性，其中水平活動反映動物的活動度，垂直活動反映動物對新鮮環(huán)境的好奇程度，糞便粒數(shù)是大鼠緊張程度的表現(xiàn)[18]。肝氣郁結(jié)證核心癥狀之一是“快感缺失”，糖水偏好實(shí)驗(yàn)則是用來檢驗(yàn)動物對幸福事件反應(yīng)能力的變化，糖水消耗量及偏嗜度降低，表明動物對獎勵敏感度低，常作為一項(xiàng)反映動物愉悅體驗(yàn)?zāi)芰Φ闹笜?biāo)[19-20]。本研究表明，大鼠在去勢后，水平運(yùn)動得分及糖水消耗率明顯下降，在慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)的作用下，去勢模型組大鼠的行為活動進(jìn)一步減少、糖水消耗率進(jìn)一步降低，提示僅僅去勢即會使大鼠活動度、好奇程度及獎賞反應(yīng)的敏感度下降，但是肝郁造模后大鼠的各癥狀加劇，快感缺乏，興趣喪失，可能是由于大鼠卵巢切除后，生殖內(nèi)分泌功能開始衰退，對抗應(yīng)激損傷的能力降低，腦內(nèi)獎賞系統(tǒng)的一些神經(jīng)元發(fā)生結(jié)構(gòu)性損傷所致。

綜上所述，采用去勢及慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)三步法復(fù)合制作圍絕經(jīng)期綜合征肝郁大鼠模型，可以有效地模仿女性圍絕經(jīng)期由于卵巢功能衰退引起的情感障礙、情緒低落的臨床表現(xiàn)。但是值得注意的是，在研究過程中發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)行為改變的易感性存在較大的個(gè)體差異，該方法并不能實(shí)現(xiàn)百分之百的成功率，因此研究過程中，必須適當(dāng)增加樣本例數(shù)[21]。另外，圍絕經(jīng)期綜合征肝郁的病理機(jī)制涉及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫等調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步闡明其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，將為圍絕經(jīng)期綜合征肝郁的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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