張巧鈴, 邱淑惠, 張永嶸, 黃天培

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

一株分離自鈾礦土壤的蘇云金芽孢桿菌的鑒定

張巧鈴, 邱淑惠, 張永嶸, 黃天培

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

從新疆某鈾礦廠土樣中分離出1株芽孢桿菌，初步確定為蘇云金芽孢桿菌(Bt)，命名為BRC-ZYR3.該菌株含有3種cry1類(lèi)基因(cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf)和2種cry9類(lèi)基因(cry9Ca和cry9Da).Bt BRC-ZYR3可產(chǎn)生5種殺蟲(chóng)晶體蛋白，分別為130、70、50、30和25 ku.此外，該菌株能耐受25 mg·L-1Cr(VI)，并在72 h內(nèi)將其還原至3.8 mg·L-1.

Cr(VI); 蘇云金芽孢桿菌; PCR-RFLP; SDS-PAGE

重金屬被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和人們的日常生活，與此同時(shí)，重金屬污染成為了全球面臨的一個(gè)重要問(wèn)題[1].我國(guó)重金屬污染事故頻發(fā)：2011年云南曲靖鉻渣非法傾倒、2012年廣西龍江河的鎘污染、2013年湖南“鎘大米事件”等.傳統(tǒng)的重金屬修復(fù)技術(shù)包括物理化學(xué)法、農(nóng)業(yè)化學(xué)調(diào)控法以及垃圾堆肥法等，存在成本高、易產(chǎn)生二次污染、破壞土壤理化性質(zhì)等問(wèn)題，難以大面積推廣應(yīng)用[2].經(jīng)過(guò)多年的探索和研究，用微生物修復(fù)技術(shù)治理重金屬污染被看作是一個(gè)有效策略[3].

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是具有殺蟲(chóng)活性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛.其最大的特點(diǎn)是在芽孢形成過(guò)程中能夠產(chǎn)生1個(gè)或多個(gè)伴孢晶體，亦稱(chēng)殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)[4].Bt殺蟲(chóng)劑對(duì)人畜無(wú)害、不污染環(huán)境，因而在生物防治中占有極其重要的地位[3].土壤作為微生物生存的最佳介質(zhì)，也是Bt分布最為豐富的生境，從不同生態(tài)環(huán)境的土壤樣品中分離、篩選及開(kāi)發(fā)利用天然的Bt菌株，始終是一項(xiàng)重要的研究任務(wù)[5].本試驗(yàn)從新疆某鈾礦廠采集的土樣中分離得到1株Bt菌株，進(jìn)一步利用PCR-RFLP鑒定體系和SDS-PAGE技術(shù)研究該菌株的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因類(lèi)型和表達(dá)情況，并分析其對(duì)Cr(VI)的還原能力及耐受性，以期為利用Bt進(jìn)行生物防治的同時(shí)有效治理Cr(VI)污染提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 土樣采集與菌株分離

土樣來(lái)源于新疆某鈾礦廠，采集其土表以下3 cm左右的土壤，裝入采集袋中備用.采用醋酸鈉—抗生素篩選法[6]篩選菌株.

1.2 培養(yǎng)基、試劑與酶

配制液體LB、固體LB、固體1/2 LB培養(yǎng)基以及生理生化培養(yǎng)基；配制堿性復(fù)紅染色液、1%酸性復(fù)紅水溶液、5% α-萘酚乙醇、1.6%溴甲酚紫、20%尿素溶液、5% FeCl3水溶液、40% KOH溶液、Lugco碘液.PCR所用試劑和限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司.

1.3 顯微樣品制備與晶體觀察

將菌株接種于1/2 LB培養(yǎng)基上，每隔6-8 h肉眼觀察菌落形態(tài)，取樣并按常規(guī)的石炭酸復(fù)紅染色方法進(jìn)行染色，觀察有無(wú)營(yíng)養(yǎng)體、孢子囊、芽孢、伴孢晶體生成，共觀察3 d.

1.4 主要生理生化指標(biāo)的鑒定

典型生理生化指標(biāo)的測(cè)定，包括各種糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V.P)反應(yīng)、脲酶水解、七葉靈利用、卵磷脂酶、精氨酸脫羧酶、菌膜形成[7].

1.5 Btcry基因型的鑒定

以Bt質(zhì)粒DNA作為PCR模板，合成10對(duì)cry1-cry10基因通用鑒定引物，利用PCR-RFLP對(duì)該菌株的cry基因型進(jìn)行鑒定[8].

1.6 Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的分析

收集Bt孢晶混合物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳[9].

1.7 對(duì)Cr(VI)還原能力及耐受性分析

向含有25 mg·L-1Cr(VI)的培養(yǎng)基中接種Bt菌株，每隔12 h取樣，測(cè)量體系中剩余Cr(VI)的濃度，以分析Bt對(duì)Cr(VI)的還原情況[10].將Bt菌株適量接種于不同Cr(VI)濃度(0、25、50、75、100 mg·L-1)的培養(yǎng)基中，6 h后取樣，測(cè)定Cr(VI)的濃度，以分析Bt對(duì)Cr(VI)的耐受性[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

源自鈾礦的土壤樣品經(jīng)醋酸鈉—抗生素分離法處理后，挑取到1個(gè)類(lèi)似Bt的菌落，將其接種到1/2 LB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，菌落呈乳白色且有粗糙褶皺，邊緣不整齊，單菌落呈圓盤(pán)狀，在1/2 LB平板培養(yǎng)時(shí)在菌苔邊緣出現(xiàn)明顯的輻射狀；液體培養(yǎng)時(shí)，搖勻后均勻渾濁，無(wú)明顯的顆粒狀；制片時(shí)菌斑亦均勻平整，未見(jiàn)顆粒狀；經(jīng)復(fù)紅染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其營(yíng)養(yǎng)體呈桿狀，菌端鈍圓；孢子囊呈桿狀，比營(yíng)養(yǎng)體稍膨脹，囊內(nèi)一端為芽孢，另一端有伴孢晶體；當(dāng)孢子囊破裂時(shí)釋放出芽孢和晶體，芽孢呈透明卵圓形，伴孢晶體呈紫色菱形(圖1).根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)分析，將該菌株初定為Bt，并命名為BRC-ZYR3.

A：營(yíng)養(yǎng)期；B：孢子囊期；C：裂解期.圖1 光學(xué)顯微鏡下的Bt菌株BRC-ZYR3Fig.1 Morphology of Bt BRC-ZYR3 observed under the optical microscope

2.2 菌株的生理生化鑒定

對(duì)分離株BRC-ZYR3的典型生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果表明，該菌株對(duì)各種糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V. P)、脲酶水解、七葉靈利用、卵磷脂酶、精氨酸脫羧酶、菌膜形成均呈陽(yáng)性反應(yīng)，該鑒定結(jié)果與伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)中Bt的鑒定內(nèi)容[11]相符，確認(rèn)BRC-ZYR3為Bt.

2.3 菌株cry基因型的鑒定

以分離到的菌株BRC-ZYR3質(zhì)粒DNA作為模板，利用PCR-RFLP方法對(duì)BRC-ZYR3的cry基因型進(jìn)行鑒定.其中，由通用引物K5un2/K3un2擴(kuò)增出約1.6 kb的目的條帶，說(shuō)明菌株BRC-ZYR3含有cry1/cry7/cry9型基因.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ/PstⅠ雙酶切分析，通過(guò)比對(duì)，初步確定該菌株所含cry1型基因?yàn)閏ry1Ba、cry1Bb和cry1Be/1Bf組合，所含cry9型基因?yàn)閏ry9Ca和cry9Da組合，不含cry7型基因(圖2).

2.4 菌株伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結(jié)果表明，菌株BRC-ZYR3的晶體主要由分子質(zhì)量為130、70、50、30和25 ku的蛋白組成(圖3).研究表明，通常cry1/cry7/cry9型基因編碼的蛋白為130 ku[12]，說(shuō)明PCR-RFLP分析正確.

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：以K5un2和K3un2為引物，以Bt BRC-ZYR3的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的cry1/cry7/cry9基因PCR產(chǎn)物；2：以Bt BRC- ZYR3的cry1/cry7/cry9基因PCR產(chǎn)物為模板，用PstⅠ和XbaⅠ雙酶切得到的片段.圖2 利用PCR-RFLP技術(shù)分析Bt BRC-ZYR3菌株的cry基因型Fig.2 Detection of cry gene types of Bt BRC-ZYR3 with PCR-RFLP M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：Bt BRC-ZYR3 ICPs.圖3 Bt BRC-ZYR3殺蟲(chóng)晶體蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of Bt BRC-ZYR3 ICPs

2.5 菌株Cr(VI)還原能力及耐受性分析

Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，72 h后，Bt BRC-ZYR3可將Cr(VI)濃度降至3.8 mg·L-1.

3 討論

本研究通過(guò)醋酸鈉—抗生素法對(duì)含鈾礦的土壤樣品進(jìn)行分離，獲得1株菌株，其形態(tài)和主要生理生化指標(biāo)與Bt相符，被命名為BRC-ZYR3.

Bt作為目前應(yīng)用最為廣泛的一種微生物殺蟲(chóng)劑，其殺蟲(chóng)活性與cry基因編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白的特異性密切相關(guān)[13].Bt不同亞種的殺蟲(chóng)晶體蛋白可由單一或多個(gè)不同大小級(jí)別的毒蛋白組成[14].本研究采用PCR-RFLP鑒定體系對(duì)BRC-ZYR3進(jìn)行cry基因型鑒定.結(jié)果表明：該菌株含有cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf、cry9Ca和cry9Da5種cry基因.據(jù)報(bào)道，cry1類(lèi)毒素蛋白對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)具有毒殺活性，其中cry1Ba的毒素蛋白對(duì)小菜蛾表現(xiàn)出較高的活性；cry9類(lèi)毒素蛋白對(duì)甜菜夜蛾有高毒力[15-16].比較SDS-PAGE結(jié)果與cry基因型發(fā)現(xiàn)，該菌株表達(dá)約130 ku的晶體蛋白，這與PCR-RFLP檢測(cè)含有cry1和cry9基因表達(dá)的蛋白大小一致.此外，SDS-PAGE結(jié)果顯示，菌株還表達(dá)70、50、32和25 ku的蛋白，而PCR-RFLP未檢測(cè)出相應(yīng)大小的蛋白.通常大小為70 ku的蛋白是cry2類(lèi)產(chǎn)物，50 ku的蛋白可能是Cry2Ab的降解產(chǎn)物，也可能是其他未知cry型基因編碼產(chǎn)物，對(duì)其有待進(jìn)一步研究.由此可知，PCR-RFLP結(jié)果不能完全反映這些基因在菌株中的表達(dá)情況，不足以證明菌株的殺蟲(chóng)效果，而SDS-PAGE結(jié)果更能明確Bt菌株可能的殺蟲(chóng)效果[17].

近年來(lái)，微生物治理重金屬污染備受重視，即利用原土壤中的土著微生物對(duì)特定重金屬吸收、沉積，從而修復(fù)被污染土壤[18].本研究表明，Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，且72 h后，可將其還原至3.8 mg·L-1.本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，從源自水樣、土壤、植物、動(dòng)物糞便、食品、昆蟲(chóng)和飲料的Bt菌株中都能篩選出快速還原Cr(VI)的菌株[3]，表明Bt有望在被作為生物農(nóng)藥應(yīng)用的同時(shí)，治理Cr(VI)污染，這是值得深入研究的一個(gè)方向.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Identification of aBacillusthuringiensisstrain isolated from uranium soil

ZHANG Qiao-ling, QIU Shu-hui, ZHANG Yong-rong, HUANG Tian-pei

(Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agricultureand Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

A soil sample was collected from a factory of uranium-mine in Xinjiang Province, China. A new isolate, designated as BRC-ZYR3, was identified asBacillusthuringiensis(Bt). The results showed that Bt BRC-ZYR3 harboredcry1Ba,cry1Bb,cry1Be/1Bf,cry9Caandcry9Dagenes and encoded 130, 70, 50, 30 and 25 ku insecticidal crystal proteins (ICPs). And Bt BRC-ZYR3 resistant to 25 mg·L-1Cr(VI) could reduce Cr(VI) to 3.8 mg·L-1.

Cr(VI);Bacillusthuringiensis; PCR-RFLP; SDS-PAGE

2014-01-27

2014-04-18

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2011AA10A203)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31201574、31071745)；福建省教育廳項(xiàng)目“教育廳高校領(lǐng)軍人才”(k8012012a).

張巧鈴(1988-)，女，碩士研究生.研究方向：微生物分子生物學(xué).Email：qiaoling068@163.com.通訊作者黃天培(1979-)，男，副研究員，博士.研究方向：微生物藥物.Email：tianpeihuang@126.com.

Q89

A

1671-5470(2015)02-0131-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.004