全鑫等

摘 要：為了優(yōu)化全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，提高其對全蝕病的抑制效果，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法（Response surface methodology）對小麥全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。生防菌株YB-81的最優(yōu)發(fā)酵條件為：時間36 h，溫度36 ℃，初始pH值8.0，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化鈉0.20%。在此培養(yǎng)條件下試驗，其菌落總數(shù)為18.8億個·mL-1，較基礎培養(yǎng)基提高了72%，對全蝕病菌抑制率達到87.2%，較優(yōu)化前提高了32.5%。生防菌 YB-81的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定， 可為該菌大規(guī)模生產(chǎn)應用提供理論基礎。

關鍵詞：小麥全蝕??；生防菌；響應面法；發(fā)酵

中圖分類號： S476.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.013

Abstract： In order to raising the antagonistic effect， the growth conditions and culture medium of biocontrol strain YB-81 was optimized based on single factor test. The optimal culture conditions of the biocontrol strain YB-81 were determined for 0.53% beef extract+glucose（1∶1）， 0.99% peptone， 0.20% odium chloride， temperature at 36 ℃， pH 8.0， speeding at 200 r·min-1， the incubation time of 36 h. The total numbers of colony was 1.88×109·mL-1， improving by 72%， and the inhibition rate to Gaeumannomyces gramims was 87.2%， improving by 32.5% with the optimal growth conditions. The optimal growth condition of the biocontrol strain YB-81 was identified， providing a theoretical basis for enlargement of production.

Key words： wheat take-all；biocontrol strain；response surface methodology；fermentation

小麥全蝕?。╓heat take-all）是一種典型的根部土傳病害，由子囊菌亞門的禾頂囊殼菌小麥變種（Gaeumannomyces gramims var. tritici）侵染所致[1-4]。小麥發(fā)病后，植株根部變黑，分蘗減少，成穗率降低，千粒質(zhì)量下降，甚至全株枯死，減產(chǎn)幅度很大，民間稱此病害為“小麥癌癥”。最近5年，小麥全蝕病擴展迅速，造成嚴重危害， 且防控困難已經(jīng)成為一種非常頑固的土傳病害。目前，對全蝕病的防治依靠化學藥劑拌種，常規(guī)藥劑防治效果不好，全蝕凈防效較好但成本太高。

YB-81菌株是河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所利用現(xiàn)代微生物篩選和分子生物學技術培育出的對小麥全蝕病具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌，通過室內(nèi)生測試驗以及田間試驗證明對小麥全蝕病菌有較好的防治作用，目前該菌株專利已授權（專利號2010101 99739.1）。本試驗采用響應面法優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件，目的是為提高該菌株的防病效果，進一步中試生產(chǎn)，為應用于大田提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌株及培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌YB-81和小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces gramims var. tritici）均由河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供?；A培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，小麥全蝕病菌培養(yǎng)基為PDA。

1.2 方 法

1.2.1 生長量的測定 采用平板菌落計數(shù)法[5]。各處理培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋涂板后，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)36～48 h，調(diào)查平板菌落數(shù)，然后計算活菌數(shù)（cfu·mL-1）。

1.2.2 抑菌率測定 抑菌率的測定采用含毒介質(zhì)法[6]。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 通過單因素試驗，測定不同時間、溫度、初始pH值、藥瓶轉(zhuǎn)速對YB-81菌株發(fā)酵效果的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗 響應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設計，選取對發(fā)酵培養(yǎng)基有顯著影響的3個因素即碳源、氮源及無機離子，采用單因素試驗方法確定3個因素的試驗點，每個因素選擇2個水平，測定各發(fā)酵培養(yǎng)基中芽孢桿菌的生長量。在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，選取碳源牛肉膏+葡萄糖（1∶1） （g）、氮源蛋白胨（g）、無機離子氯化鈉（g）3個因素來研究發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件，以菌落總數(shù)為響應值，利用Design-Exper.8.05軟件設計了3因素3水平的響應面試驗（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)發(fā)酵條件

通過設置不同時間、溫度、初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速優(yōu)化菌株YB-81的發(fā)酵條件，結(jié)果如圖1～圖4所示。菌落總數(shù)與抑菌率的變化趨勢基本一致，菌落總數(shù)越高，抑菌率也越高。發(fā)酵時間36 h抑制率達最高80.6%，菌落總數(shù)16.6億個·mL-1；隨著發(fā)酵溫度的上升菌落總數(shù)逐漸增多，在36 ℃時發(fā)酵代謝物此時的抑菌作用最強，菌落生長總數(shù)也最多，40 ℃ 時抑制率明顯降低；pH值8.0時，抑制率和菌落總數(shù)均在最高點，與其他處理差異顯著；芽孢桿菌在5個不同搖床轉(zhuǎn)速條件下，抑制率變化不明顯，菌落總數(shù)逐漸增多，在200 r·min-1菌落總數(shù)達到最大值16.2億個·mL-1。

2.2 生防芽孢桿菌YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設計

通過單因素試驗，得出發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）中最佳碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）添加量為0.5 g，最佳氮源蛋白胨1.0 g，最佳無機離子氯化鈉0.20 g。

2.3 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基

2.3.1 響應面優(yōu)化試驗 以菌落總數(shù)為響應值，利用Design-Exper.8.05軟件設計了3因素3水平的響應面試驗，菌落總數(shù)響應曲面分析試驗結(jié)果見表2。

根據(jù)軟件對表2中試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到生防芽孢桿菌培養(yǎng)基設計過程中A碳源、B氮源、C無機離子的二次多項回歸模型：

Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C2

2.3.2 響應曲面方差分析 通過表3可以看出，該模型的F值為38.03說明模型是顯著的，各因素中BC和B2顯著；均二次方A2、C2極顯著。

2.3.3 響應曲面圖與等高值線圖的分析 交互效應的強弱可用等高線的形狀來映出， 橢圓形表示兩因素交互作用顯著， 而圓形則與之相反。由圖4～圖6可知，碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）（A）、氮源蛋白胨（B）、無機離子氯化鈉（C）之間的相互作用對菌落總數(shù)的影響。

如圖中4所示，碳源與氮源之間存在交互作用，當碳源在零水平時，在氮源增加的同時，菌落總數(shù)也逐漸增加，當碳源超過0.5 g以后，菌落總數(shù)不再增加。從等高線圖中可直觀看出兩因素交互作用不顯著。

圖5顯示了碳源與無機離子之間交互作用不顯著，從其等高線可直觀看出，因為等高線的形狀反應了交互效應的強弱大小，圓形表示兩個因素作用不顯著。

由圖6可知，把氮源加入量固定于零水平（1.0 g）時，氮源與培養(yǎng)基中無機離子交互影響效應特點是：隨著氮源的變化，菌落總數(shù)先上升后降低；適當?shù)脑黾拥纯梢詼p少一定量無機離子。說明氮源與無機離子有一定的交互作用。

以上3個響應面均為開口向下，說明響應值（菌落總數(shù)）存在極大值，3個圖形的等高線中心均位于-1～1之間，表明培養(yǎng)基最優(yōu)條件存在于所設計的因素水平范圍之內(nèi)。模型培養(yǎng)基優(yōu)化條件為：碳源0.53 g，氮源0.99 g， 無機離子0.20 g，在此條件下，模型預測菌落總數(shù)為168.408 ×107個·mL-1。

2.3.4 模型驗證 通過Plackett-Burman試驗設計篩選出全蝕病生防菌株YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基的3個影響因素，模型理論條件牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化鈉0.20%，這3個主要因素對菌株YB-81生長條件存在顯著影響。在此條件下進行驗證試驗，經(jīng)3次平行驗證試驗，取平均值，實際菌落總數(shù)為18.8億個·mL-1，與模型預測值基本相符，比基礎培養(yǎng)基提高了72%，對全蝕病菌抑制率達到87.2%，較優(yōu)化前提高了32.5%。

3 結(jié)論與討論

小麥全蝕病是小麥上的一種毀滅性病害，民間俗稱“小麥癌癥”。 枯草芽孢桿菌YB-81菌株經(jīng)過室內(nèi)生測、盆栽試驗、田間試驗已驗證其對小麥全蝕病有較好的抑制作用，同時通過拌種處理，菌株進入土壤，能夠改善土壤環(huán)境，對小麥全蝕病的長期預防與防治大有益處。目前該菌株專利已授權（專利號2010101 99739.1）。利用該生防菌株研發(fā)的微生物菌劑已經(jīng)得到了農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥大田試驗批準證書（農(nóng)藥試驗證號：SY201001691），已完成農(nóng)藥大田試驗，正在登記，該菌株在生產(chǎn)上的應用前景廣泛。

在大規(guī)模生產(chǎn)菌劑前，對菌株YB-81的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，能夠確定一套產(chǎn)率最大、最節(jié)約的發(fā)酵模式。傳統(tǒng)上對于生防菌株的發(fā)酵通常采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合的方法[7-11]，本研究在單因素試驗基礎上采用響應面分析法對試驗結(jié)果進行數(shù)學模擬和優(yōu)化，直觀、可信度高[12]，最終確定了一系列最優(yōu)發(fā)酵條件，使其對小麥全蝕病菌的抑制率提高32.5%，菌落總數(shù)提高72%。

本試驗中對生防菌株的發(fā)酵優(yōu)化是在搖瓶發(fā)酵的基礎上進行的，當菌株進一步中試生產(chǎn)時，可以此發(fā)酵模式為基礎，但發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件還需進一步的驗證及研究。

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