郝雪英等

摘要：‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片中富含大量多糖、多酚物質(zhì)，嚴(yán)重影響了總RNA提取的產(chǎn)率和質(zhì)量。為了找出適宜‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片總RNA提取的方法，本試驗(yàn)運(yùn)用試劑盒法、TRIZOL法和改良CTAB法提取其秋季葉片總RNA。結(jié)果表明，試劑盒法提取的葉片總RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在1.8以上，但產(chǎn)率一般，有DNA污染；TRIZOL法提取的總RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在1.5左右，且產(chǎn)率最低；改良CTAB法提取的總RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在2.0左右，且產(chǎn)率最高，電泳圖較清晰。說(shuō)明采用改良CTAB法提取的葉片總RNA質(zhì)量和產(chǎn)率高，可以滿足分子生物學(xué)進(jìn)一步研究的需求，是‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片總RNA提取的適宜方法。

關(guān)鍵詞：‘魯紅一號(hào)元寶楓；總RNA提??；改良CTAB法

中圖分類號(hào)：S792.35文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）03-0005-04

Comparative Study on Extraction Methods of Total RNA

from Leaves of Acer Truncatum ‘Luhong No. 1

Hao Xueying，F(xiàn)eng zhen，Lü Chuanqing

（College of Forestry，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China）

AbstractA large amount of polysaccharides and polyphenols in Acer truncatum ‘Luhong No. 1leaves have seriously affected the yield and quality of total RNA extraction.In order to obtain the appropriate method of total RNA extraction，3 methods，Kit method，TRIZOL and modified CTAB，were chosen to extract them from Acer truncatum ‘Luhong No. 1autumn leaves.The results showed that the total RNA extracted by Kit method had the general yield，the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both above 1.8，and had the pollution of DNA. That extracted by TRIZOL method had the lowest yield，the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both about 1.5. That extracted by modified CTAB method showed clear electrophoresis pattern and highest yield，and the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both about 2.0.The results demonstrated that the yield and purity of the RNA obtained by the modified CTAB method could meet the demands of molecular biology experiment.The modified CTAB method was the appropriate method for total RNA extraction from Acer truncatum ‘Luhong No. 1 leaves.

Key wordsAcer truncatum ‘Luhong No. 1；Total RNA extraction；Modified CTAB method

元寶楓冠大蔭濃、樹(shù)姿優(yōu)美、葉形美麗，在堤岸、湖邊、草地及建筑附近配植皆很雅致，是北方重要的秋色葉樹(shù)種。但在華北作庭蔭樹(shù)和行道樹(shù)時(shí)，多數(shù)表現(xiàn)一般，本課題組經(jīng)多年研究選育出的‘魯紅一號(hào)元寶楓，在擁有元寶楓觀賞特性的基礎(chǔ)上秋葉鮮紅，紅葉持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，觀賞價(jià)值高。

近幾年來(lái)，關(guān)于元寶楓的研究報(bào)道較多，但內(nèi)容偏向于植物生理、組織培養(yǎng)等方面[1～3]，有關(guān)其分子生物學(xué)的研究報(bào)道較少。從植物中提取純度高、完整性好的總RNA是進(jìn)行各項(xiàng)分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，是研究基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。到目前為止，已有許多關(guān)于植物組織總RNA提取的研究報(bào)道[4～6]，最常用的有SDS-苯酚法[7]、改良SDS-苯酚法[8]、異硫氰酸胍法[9]、CTAB法[10]、改良熱硼酸法[11]及各種試劑盒法等。因‘魯紅一號(hào)元寶楓為彩色葉樹(shù)種，含有較多的多糖多酚物質(zhì)，因而提取高純度的RNA有一定難度，嚴(yán)重影響了元寶楓分子生物學(xué)研究。為此，本試驗(yàn)使用試劑盒法、TRIZOL法、改良CTAB法對(duì)‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片總RNA提取進(jìn)行比較研究，通過(guò)檢測(cè)分析獲得了最佳提取方法，為深入開(kāi)展元寶楓基因表達(dá)等分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為其他彩色葉樹(shù)種的總RNA提取提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑

葉片采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)栽植的‘魯紅一號(hào)元寶楓，植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，秋葉鮮紅，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

試劑盒法采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；TRIZOL試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；改良CTAB法所需藥品均為本實(shí)驗(yàn)室配制。endprint

配制改良CTAB法試劑所需要的水均經(jīng)過(guò)DEPC處理，玻璃儀器在烘箱里180℃烘10小時(shí)以上，塑料耗材先用DEPC水在37℃浸泡12小時(shí)以上，然后用滅菌鍋滅菌。

1.2葉片總RNA的提取

1.2.1試劑盒法稱取100 mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。

1.2.2TRIZOL法稱取100 mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。

1.2.3改良CTAB法（1）稱取100 mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入盛有1 000 μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[含2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、25 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1.4 mol/L NaCl]的2 mL離心管內(nèi)，離心管中提前加入20 μL β-巰基乙醇，充分顛倒混勻，65℃水浴40 min，每隔十分鐘混勻一次，防止樣品凝固于試管底部。

（2） 4℃、12 000 r/min離心25 min。

（3） 取上清于新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）充分混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min。重復(fù)上述步驟。

（4） 取上清于新的1.5 mL離心管里，加入1/3體積的LiCl（8 mol/L）溶液，混勻，放入4℃冰箱過(guò)夜。

（5） 4℃、12 000 r/min離心30 min。

（6） 去掉上清液，分別用70%的乙醇和無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次。

（7） 向沉淀中加入400 μL 65℃預(yù)熱的SSTE充分溶解沉淀后，加入400 μL氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min。

（8） 取上清于新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇（-20℃放置）和1/10體積的NaAc（3 mol/L），充分混勻，于-80℃冰箱中放置30 min。

（9） 4℃、12 000 r/min離心30 min。

（10） 去掉上清液，用70%的乙醇和無(wú)水乙醇各洗滌沉淀兩次。

（11） 將乙醇晾干，加入30 μL DEPC處理過(guò)的超純水溶解沉淀，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

1.3RNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)

取1 μL RNA樣品，用ND-2000核酸蛋白分析儀進(jìn)行含量以及純度的測(cè)定。取5 μL RNA加1 μL 6×Loading Buffer，在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、10 V/cm穩(wěn)壓條件下電泳15 min，對(duì)RNA純度和完整性進(jìn)行檢測(cè)[12]。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的質(zhì)量與濃度

3種提取方法獲得的‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片總RNA的純度及產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)表l。

一般情況下，通過(guò)OD260/OD280檢測(cè)RNA的純度，高純度的RNA OD260/OD280值應(yīng)介于1.8～2.0之間，如果比值低于1.8表示含蛋白質(zhì)、多糖、多酚物質(zhì)較多，如果比值大于2.2，即表明RNA有降解。OD260/OD230值應(yīng)大于2.0，過(guò)低則表明有鹽離子污染[13]。由表1可知，試劑盒法產(chǎn)率較高；TRIZOL法產(chǎn)率最低，OD260/OD280比值為1.52，表明該方法不能有效去除總RNA中的蛋白質(zhì)、多糖多酚物質(zhì)，總RNA純度很低；改良CTAB法純度較高，OD260/OD280、OD260/OD230分別為1.98、2.07，并且產(chǎn)率也最高。

2.2總RNA樣品的電泳檢測(cè)

RNA樣品的電泳檢測(cè)是判斷RNA質(zhì)量的重要手段之一，從膠上18S和28S rRNA的完整性可判斷RNA有無(wú)降解以及降解程度，同時(shí)可判斷有無(wú)DNA、蛋白質(zhì)污染。3種方法提取的總RNA經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳得到以下圖片（圖1），結(jié)果表明，試劑盒法和改良CTAB法提取的總RNA 18S和28S條帶清晰，且28S亮度約是18S的兩倍，但試劑盒法提取的總RNA有降解現(xiàn)象且有嚴(yán)重的DNA污染（圖1A、1C）；TRIZOL法提取的總RNA 18S和28S條帶不清晰，且亮度過(guò)弱，似有降解的跡象（圖1B）。

3結(jié)論與討論

高質(zhì)量的RNA是分子生物學(xué)試驗(yàn)成功的最關(guān)鍵因素。許多研究表明，從植物的不同品種、不同器官及組織中提取高質(zhì)量的RNA難度各不相同，這主要是與植物細(xì)胞中含有的一些成分有關(guān)，例如酚類物質(zhì)、多糖、次級(jí)代謝產(chǎn)物以及RNase等。在大多數(shù)植物中，尤其是彩色葉植物，都含有大量多糖多酚物質(zhì)?！敿t一號(hào)元寶楓與其他彩色葉植物相比，其植株體內(nèi)的多糖、多酚類物質(zhì)的含量較高，這兩種物質(zhì)的存在嚴(yán)重影響了RNA提取的質(zhì)量與產(chǎn)率，因此有效地去除多糖多酚類物質(zhì)是成功地提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。

在植物細(xì)胞中，多糖和酚類物質(zhì)與核酸在空間上是相互分離的，但對(duì)組織進(jìn)行研磨破碎后，它們會(huì)與RNA相互作用，影響RNA的提取及后續(xù)反應(yīng)[14]。多糖的多數(shù)理化性質(zhì)與核糖核酸極其相似，很容易在去除多糖的同時(shí)降低RNA的產(chǎn)量；此外多糖可抑制酶的活性，被多糖污染了的RNA樣品就無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。而殘留在樣品中酚類物質(zhì)隨著氧化程度的增加顏色會(huì)變成深褐色，被氧化的酚類化合物能穩(wěn)定地與RNA結(jié)合，導(dǎo)致RNA降解。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)運(yùn)用改良CTAB法提取的元寶楓葉片總RNA質(zhì)量最好，有效地抑制了葉片總RNA提取過(guò)程中多糖、多酚等代謝產(chǎn)物的干擾。其原因主要有：（1）較高濃度的CTAB不僅能對(duì)植物細(xì)胞有較好的裂解作用，而且能有效地分離核蛋白與核酸的復(fù)合物，同時(shí)和巰基乙醇共同作用變性蛋白、抑制RNase的活性；（2）CTAB提取緩沖液提前預(yù)熱，有效縮短了植物材料水浴的時(shí)間，降低了RNA的降解概率；（3）CTAB提取緩沖液中加入PVP以及在提取過(guò)程中加入高濃度的NaCl能有效抑制酚類的氧化及未氧化的酚類，有力地防止多糖的污染；（4）試驗(yàn)過(guò)程中加入高濃度的LiCl可去除部分多糖。上述試劑增強(qiáng)了‘魯紅一號(hào)元寶楓植物組織的裂解能力，且為反應(yīng)提供了有利的還原條件，抑制了多酚的氧化，去除多糖和蛋白的效果較好，并在試驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制RNA酶對(duì)RNA的降解作用，因此該方法提取的總RNA產(chǎn)量與純度與其他方法相比均較高，可用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。endprint

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