王麗麗，陳 林，畢桂彬，趙 松，靳風(fēng)艷，牛 豐＊

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院1.脊柱外科；2.血液腫瘤科，吉林長春130021）

多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達(dá)及其臨床意義分析

王麗麗1，陳 林1，畢桂彬1，趙 松1，靳風(fēng)艷2，牛 豐1＊

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院1.脊柱外科；2.血液腫瘤科，吉林長春130021）

目的 觀察和分析多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓液中微小RNA（miRNA）－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達(dá)及其臨床意義。方法 選取50例MM患者作為病例組，根據(jù)治療效果將其分為初治組（19例）、難治組（18例）和緩解組（13例），選取20例非惡性血液疾病患者作為對照組。對各組患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達(dá)水平和血清β2微球蛋白（β2－MG）水平進(jìn)行檢測和比較。結(jié)果 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05）。其中，難治組患者骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平顯著高于其他三組，miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平顯著低于其他三組，初治組患者骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平顯著高于緩解組或?qū)φ战M，miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平顯著低于緩解組或?qū)φ战M，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；直線相關(guān)分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達(dá)水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達(dá)水平（r＝－0.698）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），多元線性回歸分析結(jié)果顯示，MM患者的血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（標(biāo)化相關(guān)系數(shù)＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）。結(jié)論 MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表達(dá)水平與患者對化療的反應(yīng)性和腫瘤負(fù)荷具有相關(guān)性，可用于評價(jià)患者病情的進(jìn)展、預(yù)測治療效果和患者的預(yù)后。

多發(fā)性骨髓瘤；微小RNA；骨髓液；實(shí)時(shí)PCR；β2微球蛋白

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1461）

微小RNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，可通過抑制特異靶基因的翻譯或直接降解靶基因?qū)蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有研究結(jié)果顯示，miRNA的異常表達(dá)可能參與了多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及耐藥等過程，而且某些miRNA可作為MM的有效治療靶點(diǎn)［1］，本研究針對MM患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行了觀察和分析，現(xiàn)將研究的具體情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2014年1月我院收治的MM患者50例作為病例組，均符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均采集骨髓液標(biāo)本，患者的年齡為42－66歲，平均年齡為（53.8±4.9）歲，男性31例，女性19例。選取20例同期在門診接受骨髓液檢查且最終排除惡性血液病患者作為對照組，年齡為41－63歲，平均年齡為（52.5±4.6）歲，男性12例，女性8例。兩組患者的年齡、性別構(gòu)成等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 觀察指標(biāo)和檢測方法

根據(jù)歐洲血液和骨髓移植組（EMBT）對病例組中的非初治患者的療效評價(jià)，主要分為完全緩解（CR）、接近完全緩解（nCR）、部分緩解（PR）、微小緩解（MR）、無變化（NC）、病情進(jìn)展（PD）等幾個(gè)等級，并根據(jù)是否為初治及治療后的療效，將病例組患者分為初治組（19例）、難治組（18例）、緩解組（13例）。其中，難治組的納入標(biāo)準(zhǔn)為療效未達(dá)到PR等級，緩解組的納入標(biāo)準(zhǔn)為療效達(dá)到PR及以上。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－PCR）法對三組患者及對照組骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和比較，miRNA引物設(shè)計(jì)主要通過查詢Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫獲得，對于難以用常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物應(yīng)用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物將micoRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行檢測。引物設(shè)計(jì)如下：miRNA－21：forward primer 5′－GTGCAGGGTCCGAGGT－3′；miRNA－15a：forward primer 5′－CGCCTAGCAGCACATAATGG－ 3′；miRNA－16：forward primer 5′－GCCGTAGCAGCACGTAAATA－3′。

根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線判斷反應(yīng)質(zhì)量，以2－△△Ct代表目的miRNA的表達(dá)水平，其中Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)；采集病例組患者的清晨空腹外周靜脈血標(biāo)本，常規(guī)離心分離血清后，應(yīng)用放射免疫法對血清標(biāo)本中的β2微球蛋白（β2－MG）水平進(jìn)行檢測和比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料應(yīng)用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）的形式表示，多組之間比較應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行處理，兩兩比較應(yīng)用LSD法進(jìn)行處理，血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson直線相關(guān)和多元線性回歸進(jìn)行處理，以上統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達(dá)水平的比較

各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05），其中，難治組患者骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平顯著高于其它三組，miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平顯著低于其它三組，初治組患者骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平顯著高于緩解組或?qū)φ战M，miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平顯著低于緩解組或?qū)φ战M，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而緩解組與對照組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 多發(fā)性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson直線相關(guān)分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達(dá)水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達(dá)水平（r＝－0.698）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），三種miRNA表達(dá)水平與β2－MG水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖見圖1、圖2、圖3；以血清β2－MG水平為因變量，以骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16的表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（標(biāo)化相關(guān)系數(shù)＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），見表2。

表1 各組患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表達(dá)水平的比較

表2 多發(fā)性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中三種miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

microRNA是一種內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，長度約為19－24個(gè)核苷酸，可通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)域（3’UTR）靶向結(jié)合、抑制或降解目的mRNA從而對基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年來的研究結(jié)果顯示，miRNA參與了細(xì)胞的增殖、分化、生長和凋亡等生理過程和多種疾病的病理過程［2］。大量研究證實(shí)，異常表達(dá)的miRNA是惡性腫瘤發(fā)病、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子，miRNA可通過多種途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后因子從而發(fā)揮重要的抑癌或致癌作用［3］。目前，學(xué)術(shù)界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與MM相關(guān)的miRNA，其中，主要包括miRNA－15a、miRNA－16、miRNA－34a、miRNA－194－2－192簇、miRNA－18a、miRNA－18b、miRNA－335等，而這些miRNA的表達(dá)水平與患者的血清IL－17、IL－21、IL－22、IL－23、IL－27等相關(guān)細(xì)胞因子水平、ISS分期等均具有相關(guān)性［4］，miRNA基因在MM中存在較高的突變率，miRNA19a、miRNA－19b和miRNA335基因突變可能與MM的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而且miRNA基因發(fā)生突變的患者的預(yù)后更差，因此，針對這些miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測有助于對MM病程進(jìn)展和預(yù)后進(jìn)行預(yù)測和分析［5］。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平的相關(guān)性

圖2 多發(fā)性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達(dá)水平的相關(guān)性

圖3 多發(fā)性骨髓瘤患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－16表達(dá)水平的相關(guān)性

本研究將miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21作為觀察指標(biāo)，研究結(jié)果見表1，這說明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平與患者對化療藥物的反應(yīng)性具有相關(guān)性，可用于輔助預(yù)測患者的病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。miRNA－21被認(rèn)定是miRNA轉(zhuǎn)錄的主要驅(qū)動(dòng)力，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡，且與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miRNA－21在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，很多學(xué)者主張將外周血中的miRNA－21表達(dá)水平作為潛在生物標(biāo)志物用于腫瘤的診斷、療效評價(jià)以及預(yù)后預(yù)測等方面［6，7］。近年來的研究結(jié)果證實(shí)，microRNA－21與MM具有密切的相關(guān)性，MM患者的循環(huán)microRNA－21與其血kappa輕鏈、血lambda輕鏈、血清免疫球蛋白的總量均呈顯著正相關(guān)，而與其血清白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，針對MM患者循環(huán)miRNA－21的檢測可以用于反映骨髓瘤細(xì)胞的負(fù)荷，監(jiān)測MM的病情進(jìn)展［8］，而且一些研究者利用成熟miRNA－21的種子序列可通過與其靶mRNA的3’－UTR區(qū)完全互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用這一原理，將miRNA－21作為MM基因治療的靶點(diǎn)［9］。miRNA－15a、miRNA－16是被學(xué)術(shù)界認(rèn)為與MM關(guān)系密切的miRNA，體外試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，MM細(xì)胞株可表現(xiàn)為miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平的顯著異常，而經(jīng)TNF－α預(yù)處理的骨髓細(xì)胞株H929則可與MM細(xì)胞相互作用，通過調(diào)節(jié)miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平來抑制MM細(xì)胞的生長和繁殖［10］，美法侖、硼替佐米等化療藥物均可上調(diào)骨髓瘤細(xì)胞的miRNA－15a、miRNA－16的表達(dá)水平，而IL－6等細(xì)胞因子則可抑制骨髓瘤細(xì)胞miRNA－15a、miRNA－16的表達(dá)［11］。

本研究中的直線相關(guān)分析顯示，MM患者血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－21表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.599，P＜0.05），與miRNA－15a表達(dá)水平（r＝－0.829）、miRNA－16表達(dá)水平（r＝－0.698）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），多元線性回歸分析結(jié)果顯示，MM患者的血清β2－MG水平與骨髓液中miRNA－15a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（標(biāo)化相關(guān)系數(shù)＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），說明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表達(dá)水平與患者的血清腫瘤負(fù)荷標(biāo)志物水平具有一定的相關(guān)性，可用于評價(jià)MM對機(jī)體的危害程度，特別是骨髓液中miRNA－15a表達(dá)水平的下降是與MM腫瘤負(fù)荷的上升相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究選取β2－MG作為腫瘤負(fù)荷標(biāo)志物，β2－MG是一種低分子蛋白，由淋巴細(xì)胞合成并分泌，主要存在于除紅細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞以外的所有有核細(xì)胞中，MM導(dǎo)致的惡性漿細(xì)胞過度增殖和積累會(huì)導(dǎo)致β2－MG合成和分泌的增加。臨床研究已證實(shí)，MM患者的β2－MG水平可出現(xiàn)顯著升高，并且與骨髓瘤細(xì)胞的負(fù)荷相平行、與腎功能損害程度成正比，因此，β2－MG已被作為一種重要的血清學(xué)標(biāo)志物用于MM早期診斷、療效評價(jià)及預(yù)后評估［9，12］。

綜上所述，MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表達(dá)水平與患者對化療治療的反應(yīng)性和腫瘤負(fù)荷具有相關(guān)性，可用于評價(jià)患者病情的進(jìn)展、預(yù)測治療效果和患者的預(yù)后。

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Analysis on the expression of miRNA－21，miRNA－15a and miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myelo－ma and its clinical significance

WANG Li－li，CHEN Lin，BI Gui－bin，et al.（Department of Spine Surgery，The First Bethune Hospital of Jilin University，Changchun130021，China）

Objective To observe and analyze the expression of micro RNA（miRNA）－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myeloma（MM）and its clinical significance.Methods 50patients with MM were selected as the case group and divided into the initial treatment group（19cases），the refractory group（18cases）and the remission group（13cases）according to the therapeutic effects.20cases of patients without malignant hematological diseases were selected as the control group.The expression level of miRNA－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid and the serumβ2－microglobulin（β2－MG）level of the patients in all the groups were detected and compared.Results The differences of the expression levels of miRNA－21，miRNA－15a，miRNA－16in marrow liquid of the patients between all the groups were statistically significant（F＝37.839，419.707，445.998，P＜0.05）.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the patients in the refractory group was significantly higher than that in the other three groups，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than those in the other three groups.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the initial treatment was significantly higher than those in the remission group or the control group，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than the remission group or the control group.The above differences were statistically significant（P＜0.05）；Linear correlation analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was positively correlated with the expression level of miRNA－21in marrow liquid（r＝0.599，P＜0.05）level，and negatively correlated with the expression level of miRNA－15a（r＝－0.829），the expression level of miRNA－16（r＝－0.698）in marrow liquid（P＜0.05）.The multiple linear regression analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was negatively correlated with theexpression level of miRNA－15ain marrow liquid（standardized coefficient＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）.Conclusion The expression levels of miRNA－15a，miRNA－16and miRNA－21in marrow liquid of patients with MM are correlated with the reactivity of patients to the chemotherapy treatment and the tumor burden，and can be used in evaluation of the progression of the disease and prediction of the effects of the treatment and the prognosis of the patients.

multiple myeloma；micro RNA；marrow liquid；real time PCR；β2microglobulin

R733.3

A

2015－03－22）

1007－4287（2015）09－1461－04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81471165）

＊通訊作者